ヘパラン硫酸を標的とした新規糖尿病治療薬の探索

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ヘパラン硫酸分解酵素であるheparanase阻害剤開発のための、heparanaseの精製を行った。ヒトheparanaseの精製は、ヒト肝癌由来細胞株であるHepG2細胞を用いて行った。精製後に大腸菌を用いたクローニングを行い、ヒトheparanaseを精製できていることを確認した。次に、このヒトheparanaseから活性化型ヒトheparanaseを得るために、ヒト胎児腎細胞由来であるHEK293細胞にトランスフェクションを行った。前年度から今年度の初めの結果より、トランスフェクションを行うだけだと、十分量の活性化型ヒトheparanaseが得られないことがわかった。そのため、ヒトheparanaseが過剰発現しているHEK293細胞のStable transformantsを作製した。より多くの活性化型ヒトheparanaseを得るために、Stable transformantsに対してフォルスコリン刺激を行うことで、ヒトheparanaseの分泌実験を行った。その後western blotにより、活性化型ヒトheparanaseが見られる約50kDa付近にバンドを確認した。今後は、このヒトheparanaseの活性をトルイジンブルーを用いた呈色反応により確認した後で、ヘパリンセファロースを用いて活性化型ヒトheparanaseだけを単離していき、阻害剤開発研究へと応用していく。また、heparanaseノックアウトマウスを作製するために、heparanase-floxマウスの凍結精子を購入した。現在はheparanase-floxマウスの数を十分に確保しつつ、組織特異的heparanaseノックアウトマウスを作製している。ヘテロに欠損したマウスは作製できたので、現在はホモに欠損したマウスの作製を行っている。ホモ欠損マウスの数が出そろい次第、解析を行っていく。