Creation of novel amino acid metabolizing enzymes by genome information and protein engineering

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令和３年度までにゲノム情報をもとに見出したPseudomonas veronii の新規NADP依存性L-アルギニン脱水素酵素（L-ArgDH）遺伝子の大腸菌での発現と発現産物の安定化に成功し、L-ArgDHとしての酵素化学的特徴の解明とL-Argの酵素分析への応用開発を行った。令和４年度は、それらの成果を研究会で口頭発表するとともに学術誌Proteins Expr. Purif.へ論文として、また日本ビタミン学会和文誌に論文紹介を行った。一方、ゲノム情報から好熱性胞子形成菌Geobacillus kaustphilusに２種類のアラニン脱水素酵素（AlaDH）の遺伝子ホモログ（GK2752とGK3448遺伝子）を見出した。両遺伝子の大腸菌での発現に成功し、両発現産物が強いAlaDH活性を持つことを確認し、それぞれを組換え大腸菌から均一に精製し、酵素化学的特徴の解明、立体構造の解明した。また、両酵素活性の生理的機能を解明するために、栄養（増殖）と胞子（耐久）細胞における酵素の発現様式を解析した。その結果、栄養型細胞から精製したAlaDHはGK3448-AlaDHに、一方胞子から精製したAlaDHはGK2752-AlaDHとそれぞれのN-末酸のアミノ酸配列(数残基）が一致することが明らかになった。この成果は、2つの異なるAlaDHがそれぞれ、異なる細胞増殖ステージで生産されていることを最初に示したもので、AlaDHの生理的機能の解明への今後の展開が期待できる。この成果は学術誌Biochim. Biophys. Acta.に投稿し掲載された。さらに、ゲノム情報に基づいたアミノ酸脱水素酵素の検索を行い、好熱菌のL-トリプトファン脱水素酵素ホモログ遺伝子と超好熱アーキアのロイシン脱水素酵素遺伝子の大腸菌での発現に成功した。両者酵素の精製と特徴の解析と機能改変を現在進めている。