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Creation of novel amino acid metabolizing enzymes by genome information and protein engineering

通过基因组信息和蛋白质工程创建新型氨基酸代谢酶

基本信息

批准号：
20K05816
负责人：
大島敏久
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Osaka Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K05816/
关键词：
耐熱性酵素人工酵素アミノ酸脱水素酵素ゲノム情報酸化還元酵素酵素リアクター機能改変アミノ酸代謝 L-アルギニン脱水素酵素 L-アルギニン酵素分析アミノ酸代謝関連酵素構造と機能耐熱性酸化還元酵素アミノ酸脱炭酸酵素タンパク質工学酵素分析新規アミノ酸代謝酵素

项目摘要

令和３年度までにゲノム情報をもとに見出したPseudomonas veronii の新規NADP依存性L-アルギニン脱水素酵素（L-ArgDH）遺伝子の大腸菌での発現と発現産物の安定化に成功し、L-ArgDHとしての酵素化学的特徴の解明とL-Argの酵素分析への応用開発を行った。令和４年度は、それらの成果を研究会で口頭発表するとともに学術誌Proteins Expr. Purif.へ論文として、また日本ビタミン学会和文誌に論文紹介を行った。一方、ゲノム情報から好熱性胞子形成菌Geobacillus kaustphilusに２種類のアラニン脱水素酵素（AlaDH）の遺伝子ホモログ（GK2752とGK3448遺伝子）を見出した。両遺伝子の大腸菌での発現に成功し、両発現産物が強いAlaDH活性を持つことを確認し、それぞれを組換え大腸菌から均一に精製し、酵素化学的特徴の解明、立体構造の解明した。また、両酵素活性の生理的機能を解明するために、栄養（増殖）と胞子（耐久）細胞における酵素の発現様式を解析した。その結果、栄養型細胞から精製したAlaDHはGK3448-AlaDHに、一方胞子から精製したAlaDHはGK2752-AlaDHとそれぞれのN-末酸のアミノ酸配列(数残基）が一致することが明らかになった。この成果は、2つの異なるAlaDHがそれぞれ、異なる細胞増殖ステージで生産されていることを最初に示したもので、AlaDHの生理的機能の解明への今後の展開が期待できる。この成果は学術誌Biochim. Biophys. Acta.に投稿し掲載された。さらに、ゲノム情報に基づいたアミノ酸脱水素酵素の検索を行い、好熱菌のL-トリプトファン脱水素酵素ホモログ遺伝子と超好熱アーキアのロイシン脱水素酵素遺伝子の大腸菌での発現に成功した。両者酵素の精製と特徴の解析と機能改変を現在進めている。

In 2002 and 2003, the new regulation of Pseudomonas veronii NADP dependent L-ArgDH enzyme (L-ArgDH) was successfully developed for the development of Escherichia coli, the stabilization of the product, the characterization of L-ArgDH enzyme chemistry and the development of L-Arg enzyme analysis. In the fourth year of Ling and Qing Dynasty, the achievements of the research meeting were orally presented. Purif. The two kinds of enzyme (GK2752 and GK3448) of Geobacillus kaustphilus, a thermophilic spore forming bacterium, were discovered. The successful development of E. coli, the confirmation of strong AlaDH activity, the homogeneous purification of E. coli, the elucidation of enzyme chemical characteristics, and the elucidation of three-dimensional structure of E. coli. Analysis of the physiological function of the enzyme activity and its expression in the cell As a result, AlaDH was purified from GK3448-AlaDH and a single cell was purified from GK2752-AlaDH. The N-terminal acid sequence (number of residues) was identical to that of AlaDH. The results of this research are expected to be published in the future, and the physiological function of AlaDH will be clarified. Biochim. Biophys. Acta. Posted in: In addition, the detection of acid dehydratase enzyme in Escherichia coli was successfully carried out in the presence of L-terminal dehydratase enzyme in Escherichia coli and ultra-terminal dehydratase enzyme. The purification, characterization and functional modification of the enzyme are now in progress.