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オートファジー抑制因子Rubiconとその阻害剤の機能発現機構の解明

阐明自噬抑制因子 Rubicon 及其抑制剂的功能表达机制

基本信息

批准号：
20K05839
负责人：
上西達也
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度は、Rubiconのドメイン欠損変異体をヒト培養細胞に一過性に発現させ、その破砕液を化合物が架橋されたセファロースビーズと混合することで、化合物との相互作用にはRubiconのC末端側の一部の領域が重要であるという示唆を得た。そこで今年度はその再現を試みたものの、遊離の化合物の存在下でこの相互作用が競合的に阻害されず、むしろビーズと共沈するRubiconの量が増加したことから、Rubiconはビーズに架橋された化合物と相互作用していたというよりも、変性して沈殿していた可能性が高まった。なお、当初のスクリーニングにおいても両者の直接の結合の検出は行われていなかったため、新たに理研の長田研究室および東大の濡木研究室との共同研究で、Rubicon発現細胞の破砕液ではなく高度に精製されたRubiconを用いて、直接的な結合能を有する化合物のスクリーニングを開始している。一方、既報通りに実際にRubiconとの相互作用が確認できた14-3-3タンパク質およびNEMO以外にも、インタラクトーム解析から得られた複数の候補因子について共免疫沈降法によりRubiconとの相互作用の有無を引き続き調べた。リボソームタンパク質であるRPS17およびRPS27LはRubiconとは共沈しなかった。一方、昨年度に見出していた新規相互作用因子であるCa2+結合膜タンパク質との共沈に必要なRubiconのドメインを探索したところ、C末端の比較的広い領域が必須であることが判明した。さらにCa2+結合膜タンパク質についても同様に絞り込みを行ったところ、細胞質領域のC末端ドメインがRubiconとの相互作用に重要であることが示唆された。また、蛍光顕微鏡や近接ライゲーションアッセイにより、両者が細胞内で共局在することも確認している。

In the year of last year, the Rubicon system was in short supply. As soon as it was detected, the broken liquid compound was used to analyze the chemical mixture, and the compound interaction was detected in the C-terminal of the Rubicon. This year, we will see again that in the presence of compounds that interact with each other, we can see that there is a high probability that the interaction between compounds is highly probable, and that it is possible to co-precipitate Rubicon in the presence of chemical compounds, such as, Rubicon, and so on. In the first place, it was found that there was a high level of cytopathic acid in the laboratory of osmosis wood in Nagata Research Laboratory, a joint research lab in Nagata, a joint research laboratory in Nagata, a joint research lab in Nagata, a joint research lab in Nagata, and a direct combination of chemical compounds. the results show that the quality of Rubicon is very high, and the direct combination can be used to detect the beginning of the cycle of chemical compounds. On the one hand, it was reported that the international Rubicon interaction confirmed that the interaction was not found outside the NEMO, and that the multiplicative candidate factor was analyzed. The co-immunoprecipitation method, the Rubicon interaction, and the interaction were introduced. RPS17, RPS27L, Rubicon, co-sink, sink and sink. On the one hand, it was announced last year that the new regulation interaction factor (Ca2+) combined with the membrane system (Rubicon) must be detected in the field of C-terminal interaction. The combination of Ca2+ membranes is very important. In the same way, it is important to indicate the importance of interaction in the field of C-terminal interaction. In this case, we are in close contact with each other and confirm that we are in the same cell as we are.