オートファジー抑制因子Rubiconとその阻害剤の機能発現機構の解明

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昨年度は、Rubiconのドメイン欠損変異体をヒト培養細胞に一過性に発現させ、その破砕液を化合物が架橋されたセファロースビーズと混合することで、化合物との相互作用にはRubiconのC末端側の一部の領域が重要であるという示唆を得た。そこで今年度はその再現を試みたものの、遊離の化合物の存在下でこの相互作用が競合的に阻害されず、むしろビーズと共沈するRubiconの量が増加したことから、Rubiconはビーズに架橋された化合物と相互作用していたというよりも、変性して沈殿していた可能性が高まった。なお、当初のスクリーニングにおいても両者の直接の結合の検出は行われていなかったため、新たに理研の長田研究室および東大の濡木研究室との共同研究で、Rubicon発現細胞の破砕液ではなく高度に精製されたRubiconを用いて、直接的な結合能を有する化合物のスクリーニングを開始している。一方、既報通りに実際にRubiconとの相互作用が確認できた14-3-3タンパク質およびNEMO以外にも、インタラクトーム解析から得られた複数の候補因子について共免疫沈降法によりRubiconとの相互作用の有無を引き続き調べた。リボソームタンパク質であるRPS17およびRPS27LはRubiconとは共沈しなかった。一方、昨年度に見出していた新規相互作用因子であるCa2+結合膜タンパク質との共沈に必要なRubiconのドメインを探索したところ、C末端の比較的広い領域が必須であることが判明した。さらにCa2+結合膜タンパク質についても同様に絞り込みを行ったところ、細胞質領域のC末端ドメインがRubiconとの相互作用に重要であることが示唆された。また、蛍光顕微鏡や近接ライゲーションアッセイにより、両者が細胞内で共局在することも確認している。