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不凍タンパク質を利用した低温牛胚保存法による牛胚移植の高度化

抗冻蛋白低温牛胚胎保存法在牛胚胎移植中的进展

基本信息

批准号：
20K06370
负责人：
阪谷美樹
金额：
$ 2.25万
依托单位：
National Agriculture and Food Research Organization
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度はこれまでに牛体外受精胚の緩慢凍結融解後の生存性に効果があると認められたIII型不凍タンパク質（AFP） 1.0microG/mL添加区を用いて胚の遺伝子発現を評価し、さらに移植試験を実施した。食肉センター由来卵巣から回収した卵子により作成した体外受精胚盤胞を用い、対照区は通常の凍結保存液にて保存し、AFP区はAFP 1.0microG/mLの培養液にて1h前培養後、AFP 1.0microG/mLを含む凍結液にて保存した。液体窒素内で少なくとも1か月以上保管した胚を試験に供試した。培養液・保存液への血清利用は胚の遺伝子発現異常や産子の過大化を引き起こす可能性があるため、本課題では胚発生培養液、凍結保存液は血清フリーとした。遺伝子発現試験では融解後、38.5℃ 5% CO2 5% O2気相下で 20% FBS, 還元剤 100microM beta-mercaptoethanolを含むM199培養液中にて24ｈ回復培養後の生存胚のみを回収し、qRT-PCRにて各種遺伝子発現（HSPA1A, POU5F1, NANOG, CDX2, IFNT, CASPASE3）を比較した。ストレスマーカーであるHSPA1Aの発現はAFP区で有意に低く、栄養外胚葉マーカーであるCDX2の発現はAFP区で有意に高かったが、他の内部細胞塊マーカーやアポトーシスマーカー遺伝子に差は認められなかった。HSPA1Aの結果からAFP添加区で凍結による障害が軽減される可能性が示唆された。また、移植試験では発情同期化処理した黒毛和種雌牛に対照区2頭，AFP区1頭に対し、それぞれ1個ずつの胚を移植したところ、対照区1頭のみが受胎した。本結果では、例数が少なくAFPの添加による受胎性効果は評価できていない。

This year, the viability of bovine IVF embryos after slow freezing and thawing was evaluated by using a 1.0 microG/mL addition zone, and the transfer test was conducted. In vitro fertilized blastocysts were prepared from eggs recovered from eggs, preserved in normal frozen preservation solution in irradiated area, and preserved in frozen preservation solution containing AFP 1.0 microG/mL 1 h before culture in AFP area. The liquid is stored for more than one month. Culture solution, preservation solution, serum, embryo culture solution, frozen preservation solution, serum, embryo culture solution, frozen preservation solution, serum After thawing, 20% FBS, 100microM beta-mercaptoethanol and M199 culture medium were added at 38.5℃ with 5% CO2 and 5% O2 for 24h. The recovery of viable embryos and qRT-PCR were compared for the development of various genes (HSPA1A, POU 5F1, NANOG, CDX2, IFNT, CASPASE3). HSP1A is intentionally low in AFP region, and the ectoblast is intentionally high in AFP region, and its internal cell mass is intentionally low in AFP region. The results of HSPA1A show the possibility of freezing in the AFP addition zone and reducing the damage. 2 heads in the contrast zone, 1 head in the AFP zone, 1 head in the embryo transfer zone, 1 head in the contrast zone The results showed that the number of cases was less than that of AFP, and the number of cases was less than that of AFP.