Residual Structures of Denatured Proteins Studied by Two-Dimensional NMR Using a Spin-Desalting Column

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高濃度変性剤中の球状蛋白質の残存構造の解析は，蛋白質フォールディング研究にとって重要な問題である。本研究では，代表的な球状蛋白質を対象として，高濃度変性剤中におけるペプチド・アミド（NH）基の水素/重水素（H/D）交換反応を，スピン脱塩カラム利用ジメチルスルホキシド（DMSO）停止H/D交換二次元（2D）NMR法を用いて解析し，変性蛋白質中の残存構造を明らかにする。昨年度の研究で，プロテインAのBドメイン（BDPA）は，6 M塩化グアニジニウム（GdmCl）中で十分に広がったU状態においても，天然（N）状態でαヘリックスを形成している領域において，H/D交換保護因子（P）が2～5となる残存構造を有していることが明らかとなった。本年度はこの結果をさらに補強するため，N状態を不安定化したBDPA変異体L20A（残基20番目のLeuをAlaに置換した変異体）を作成し，その安定性を調査するとともに，L20A変異体のU状態におけるH/D交換反応に関する予備的実験を行った。以下の結果が得られた。(1) L20A変異体のアンフォールディング転移：222 nmの円二色性スペクトルを用いて，L20A変異体のGdmClによるアンフォールディング転移を測定し野生型のものと比較した（重水90%, pD 3.8, 15℃）。L20A変異体では，転移の中点が野生型の3.5 Mから1.7 M GdmClまで低下し，GdmCl 3.0 M以上で十分U状態にあることが分かった。(2) L20A変異体の2D NMRスペクトルとH/D交換反応測定：15N標識したL20A変異体を作成し，DMSO溶液中の1H-15N HSQCスペクトルを測定するとともに，3.0 M GdmCl中でU状態にあるL20A変異体のH/D交換反応を調べた。P値が6.0 M GdmCl中の野生型BDPAの値より10-50%程度大きくなった。