Residual Structures of Denatured Proteins Studied by Two-Dimensional NMR Using a Spin-Desalting Column

使用旋转脱盐柱通过二维 NMR 研究变性蛋白质的残留结构

• 批准号: 20K06574
• 负责人: 桑島 邦博
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K06574/
• 关键词: 蛋白質フォールディング; 水素/重水素交換; 二次元NMR; 変性状態; 残存構造

高濃度変性剤中の球状蛋白質の残存構造の解析は，蛋白質フォールディング研究にとって重要な問題である。本研究では，代表的な球状蛋白質を対象として，高濃度変性剤中におけるペプチド・アミド（NH）基の水素/重水素（H/D）交換反応を，スピン脱塩カラム利用ジメチルスルホキシド（DMSO）停止H/D交換二次元（2D）NMR法を用いて解析し，変性蛋白質中の残存構造を明らかにする。昨年度の研究で，プロテインAのBドメイン（BDPA）は，6 M塩化グアニジニウム（GdmCl）中で十分に広がったU状態においても，天然（N）状態でαヘリックスを形成している領域において，H/D交換保護因子（P）が2～5となる残存構造を有していることが明らかとなった。本年度はこの結果をさらに補強するため，N状態を不安定化したBDPA変異体L20A（残基20番目のLeuをAlaに置換した変異体）を作成し，その安定性を調査するとともに，L20A変異体のU状態におけるH/D交換反応に関する予備的実験を行った。以下の結果が得られた。(1) L20A変異体のアンフォールディング転移：222 nmの円二色性スペクトルを用いて，L20A変異体のGdmClによるアンフォールディング転移を測定し野生型のものと比較した（重水90%, pD 3.8, 15℃）。L20A変異体では，転移の中点が野生型の3.5 Mから1.7 M GdmClまで低下し，GdmCl 3.0 M以上で十分U状態にあることが分かった。(2) L20A変異体の2D NMRスペクトルとH/D交換反応測定：15N標識したL20A変異体を作成し，DMSO溶液中の1H-15N HSQCスペクトルを測定するとともに，3.0 M GdmCl中でU状態にあるL20A変異体のH/D交換反応を調べた。P値が6.0 M GdmCl中の野生型BDPAの値より10-50%程度大きくなった。

Analysis of the residual structure of <s:1> globular proteins <e:1> in high concentration modifiers, research on にとって important な issues である of protein フォ, フォ, ディ, ディ, グ. な, this study で は, representative of globular protein を like と seaborne し て, high concentration of - sex tonic に お け る ペ プ チ ド · ア ミ ド (NH) の water element/heavy water element (H/D) to exchange the 応 を, ス ピ ン salt off カ ラ ム using ジ メ チ ル ス ル ホ キ シ ド (DMSO) stop H/D exchange of two dimensional (2 D) NMR method を with い て parsing し, The residual structure of the <s:1> in the variable protein is を and ら にする にする. Yesterday で annual の research, プ ロ テ イ ン の B ド メ イ ン (BDPA) は, 6 M salt chemical グ ア ニ ジ ニ ウ ム (GdmCl) で very に hiroo が っ た U state に お い て も, natural state (N) で alpha ヘ リ ッ ク ス を form し て い る field に お い て, The H/D exchange protection factor (P) is が2 to 5となる. The remaining structures are を, て る, る, とが, ら and となった となった. Results this year は こ の を さ ら に reinforcing す る た め, N state を not stabilization し た BDPA - variant L20A (20's mesh residue の Leu を Ala に replacement し た - variants) を し consummate, そ の stability を survey す る と と も に, L20A - variant の U state に お け る H/D exchange the 応 に masato す る reserve of be 験 を line っ た. The following <s:1> result が gives られた. (1) L20A - variant の ア ン フ ォ ー ル デ ィ ン グ move planning: 222 nm の has drifted back towards &yen; dichroism ス ペ ク ト ル を with い て, L20A - variant の GdmCl に よ る ア ン フ ォ ー ル デ ィ ン グ planning move を determination し wild-type の も の と compare し た (heavy water 90%, pD 3.8, 15 ℃). L20A - variant で は, planning to move の midpoint が wild-type の 3.5 M か ら 1.7 M GdmCl ま で し, GdmCl state of 3.0 M above で very U に あ る こ と が points か っ た. (2) Determination of <s:1> 2D NMRスペ ト ト ト と とH/D exchange reverse 応 of L20A variant: 15 n し た L20A - variant を し consummate, DMSO の 1 H - 15 n HSQC ス ペ ク ト ル を determination す る と と も に, 3.0 M GdmCl で U state に あ る L20A - variant の H/D exchange the 応 を adjustable べ た. P value が6.0 M GdmCl <s:1> value よ が 10-50% degree large くなった くなった.

项目成果

The B domain of Protein A Retains Residual Structures in 6 M Guanidium Chloride as Revealed by Hydrogen/Deuterium-Exchange NMR Spectroscopy

氢/氘交换核磁共振波谱显示，蛋白 A 的 B 结构域在 6 M 氯化胍中保留了残留结构

• 发表时间: 2022
• 作者: Saeko Yanaka;Maho Yagi-Utsumi;Koichi Kato;and Kunihiro Kuwajima
• 通讯作者: and Kunihiro Kuwajima

Residual Structure of Unfolded Ubiquitin as Revealed by Hydrogen/Deuterium-Exchange 2D NMR

氢/氘交换 2D NMR 显示未折叠泛素的残留结构

• DOI: 10.1016/j.bpj.2020.10.003
• 发表时间: 2020
• 期刊: Biophysical Journal
• 影响因子: 3.4
• 作者: Yagi-Utsumi Maho;Chandak Mahesh S.;Yanaka Saeko;Hiranyakorn Methanee;Nakamura Takashi;Kato Koichi;Kuwajima Kunihiro
• 通讯作者: Kuwajima Kunihiro

Residual structures in the unfolded state of a three-helix bundle protein in 6 M guanidinium chloride studied by H/D-exchange 2D NMR

通过 H/D 交换 2D NMR 研究 6 M 氯化胍中三螺旋束蛋白未折叠状态的残余结构

• 发表时间: 2022
• 作者: Kunihiro Kuwajima;Saeko Yanaka;Maho Yagi-Utsumi;and Koichi Kato
• 通讯作者: and Koichi Kato

The H/D-exchange kinetics of unfolded ubiquitin in 6 M GdmCl studied by the DMSO-quenched 2D NMR techniques

通过 DMSO 猝灭的 2D NMR 技术研究 6 M GdmCl 中未折叠泛素的 H/D 交换动力学

• 发表时间: 2020
• 作者: 畠山瑞生，上園帆風，前田真奈，德本裕乃，嶋本顕，清水孝彦，川上広宣，篠原久明，堀江一郎;桑島 邦博，矢木-内海 真穂，谷中 冴子，加藤 晃一
• 通讯作者: 桑島 邦博，矢木-内海 真穂，谷中 冴子，加藤 晃一