大腸菌のGroELにより認識されるタンパク質の中間構造状態の解析

大肠杆菌GroEL识别蛋白质中间结构状态分析

• 批准号: 06248204
• 负责人: 桑島 邦博
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06248204/
• 关键词: タンパク質の細胞内輸送; 分子シャペロン; シャペロニン; GroEL; モルテン・グロビュール状態; α-ラクトアルブミン; タンパク質折れたたみ; 巻き戻り反応

GroELは、生体内で、タンパク質折れ畳み反応の中間体を認識していると考えられている。GroELによる標的蛋白質認識の分子機構を明らかとするため、中間構造状態にあるα-ラクトアルブミン(α-LA)とGroELとの相互作用をin vitroのモデル系を用いて調べている。昨年度までの研究より、分子篩いクロマトグラフィーを用いた実験では、α-LAのモルテン・グロビュール状態とGroELとの相互作用は認められないが、モルテン・グロビュールよりさらに構造の崩れが還元α-LAは、50mMKClの存在下で、GroELと強く結合することが明らかとなっている。今年度は、分子篩クロマトグラフィーのクロマトグラムのタンパク質濃度依存より、50mMKCl存在下、pH8.0、25℃で還元α-LAとGroELとの結合定数を求め、10^7M^<-1>のオーダーであることがわかった。アポα-LAの酸側でのモルテン・グロビュール状態からの巻き戻り反応をストップトフロー蛍光法で追跡し、巻き戻りの速度過程にGroELがどのように影響するかを調べた。モルテン・グロビュール状態にあるα-LAとGroELが弱くとも互いに相互作用するとするなら、1/(結合定数)に相当するGroEL濃度で速度過程に変化が観測されるはずである。GroELが0.2μMではアポα-LAの巻き戻り反応には変化は観測されなかったが、2μM GroEL存在下では巻き戻り速度が約半分に減速するのが観測された。この結果はアポα-LAのモルテン・グロビュール状態がGroELにより認識されたその結合定数が10^5M^<-1>のオーダーであることを示している。GroELの標的蛋白質認識には、標的タンパク質とGroELとの構造の動的側面(柔らかさ)が重要と考えられる。この点を明らかとするため、トリチウムラベルされた還元α-LAの水素交換反応にあたえるGroELの影響を調べている。

据信，凹槽可以识别蛋白质折叠反应中体内中间体。为了阐明Groel靶蛋白识别的分子机制，使用体外模型系统研究了中间结构状态和凹槽中α-乳乳蛋白（α-LA）之间的相互作用。直到去年的研究表明，使用分子筛色谱法的实验并未显示α-LA和凹槽的熔融粘膜状态之间的相互作用，但已经表明，在50 mM KCl存在下，降低的α-LA在存在下与凹槽强烈结合。今年，基于分子筛色谱的色谱图的蛋白质浓度依赖性，在50 mM KCl的情况下，在pH 8.0和25°C下确定了还原α-LA和凹槽之间的结合常数，并且发现它的结合常数在10^7m^<-1>>的阶段。在Apoα-LA酸侧的熔融球状状态的倒带反应之后是停止流量荧光，以研究Groel如何影响重新调整速率过程。如果熔融的grobule状态中的α-la和凹槽即使它们弱相互作用，则应在与1/（耦合常数）的GROEL浓度下观察到速度过程的变化。在0.2μm的凹槽下，在APOα-LA的倒带反应中未观察到变化，但是在存在2μm凹槽的情况下，观察到倒带速度降低了约一半。该结果表明Apoα-LA的熔融grobule状态为10^5m^<-1>，这是由Groel识别的。据认为，靶蛋白和凹槽结构的动态方面（柔软）对于Gloel的靶蛋白识别很重要。为了阐明这一点，我们研究了凹槽对triplabel标记的还原α-LA的氢交换反应的影响。