デュシェンヌ型筋ジストロフィーに対する新規遺伝子治療法の開発

デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)は、ジストロフィン遺伝子に変異・欠失が起こり生じる遺伝性疾患である。治療法として正常なジストロフィン遺伝子を外部から投与する遺伝子治療が研究されている。正常なジストロフィン遺伝子を運搬する役目としてアデノ随伴ウイルスベクター(rAAV)が注目されている。安全性が高いrAAVは遺伝子治療によく用いられるが、搭載できる遺伝子の大きさが限られており、巨大なジストロフィン遺伝子は全長を搭載できない。そのため、ジストロフィン遺伝子を短縮したマイクロジストロフィン(uDys)をrAAVに搭載し、患者に投与する。DMD遺伝子治療の課題の一つは、uDysタンパク質に対する免疫応答とともに、rAAVベクターゲノムに対する免疫応答である。ベクターゲノムに対する免疫応答が起こる理由として、uDys搭載ベクターゲノムに存在するウイルス由来配列(ITR)、およびrAAVに誤ってパッケージングされたプラスミドバックボーンが非自己として認識されることが挙げられる。そこで本研究では、ウイルス由来配列を最小限にし、さらにプラスミドバックボーンがパッケージングされないよう、PCR増幅線状化ベクターゲノムを用いたrAAVの作製を試みた(rAAV-L-AD)。まず、rAAV-L-ADと従来型rAAVのパッケージング・発現効率を比較した。パッケージング効率に関して、rAAV-L-ADは従来型と同等であったが、発現効率に関しては従来型より劣っていた。一方で、線状化ベクターゲノムの代わりにshRNAを搭載したrAAV-L-AD-shRNAを作製したところ、これは標的遺伝子の発現を劇的に減少させることがわかった。次に、キャプシドにパッケージングされたプラスミドバックボーンの混入率を調べたところ、従来型では数多くの混入が確認されたが、rAAV-L-ADでは有意に減少していた。

デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)は、ジストロフィン遺伝子に変異・欠失が起こり生じる遺伝性疾患である。治療法として正常なジストロフィン遺伝子を外部から投与する遺伝子治療が研究されている。正常なジストロフィン遺伝子を運搬する役目としてアデノ随伴ウイルスベクター(rAAV)が注目されている。安全性が高いrAAVは遺伝子治療によく用いられるが、搭載できる遺伝子の大きさが限られており、巨大なジストロフィン遺伝子は全長を搭載できない。そのため、ジストロフィン遺伝子を短縮したマイクロジストロフィン(uDys)をrAAVに搭載し、患者に投与する。DMD遺伝子治療の課題の一つは、uDysタンパク質に対する免疫応答とともに、rAAVベクターゲノムに対する免疫応答である。ベクターゲノムに対する免疫応答が起こる理由として、uDys搭載ベクターゲノムに存在するウイルス由来配列(ITR)、およびrAAVに誤ってパッケージングされたプラスミドバックボーンが非自己として認識されることが挙げられる。そこで本研究では、ウイルス由来配列を最小限にし、さらにプラスミドバックボーンがパッケージングされないよう、PCR増幅線状化ベクターゲノムを用いたrAAVの作製を試みた(rAAV-L-AD)。まず、rAAV-L-ADと従来型rAAVのパッケージング・発現効率を比較した。パッケージング効率に関して、rAAV-L-ADは従来型と同等であったが、発現効率に関しては従来型より劣っていた。一方で、線状化ベクターゲノムの代わりにshRNAを搭載したrAAV-L-AD-shRNAを作製したところ、これは標的遺伝子の発現を劇的に減少させることがわかった。次に、キャプシドにパッケージングされたプラスミドバックボーンの混入率を調べたところ、従来型では数多くの混入が確認されたが、rAAV-L-ADでは有意に減少していた。