新規開発CRISP/Cas9システムによる病原変異の修繕法開発

使用新开发的 CRISP/Cas9 系统开发致病性突变修复方法

• 批准号: 19J21619
• 负责人: 大浦 聖矢
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-25 至 2022-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19J21619/
• 关键词: CRISPR/Cas9; ゲノム編集; 遺伝子治療; ハンチントン病; CAGリピート

CRISPR/Cas9 システムは小分子RNA (gRNA) とCas9 ヌクレアーゼの複合体により任意の標的DNAを切断する。ただし、標的配列の直下流には 5’-NGG-3’配列が必要で、これが標的配列の制約となる。近年、より任意の配列を標的とした遺伝子改変を実現するために、5’-NGN-3’を認識できる改変型Cas9の開発に携わり、共著者として報告した。そこで本研究では、この改変型Cas9を用いて、従来の野生型Cas9ではアクセスできなかったハンチントン病の過伸長CAGリピート配列の修復法開発に取り組んだ。まず、ES細胞・受精卵における、改変型Cas9のNG(A/T/C)-PAMを有する標的配列の切断効率を調べた。その結果、ES細胞においては、改変型Cas9は野生型Cas9よりも効率よくNG(A/T/C)-PAMを有する標的ゲノムDNAを切断した。しかしながら、受精卵においては、改変Cas9を使用しても、NG(A/T/C)-PAMを有する標的ゲノムDNAは殆ど切断されなかった。続いて、ハンチントン病のモデルマウスからES細胞を樹立し、Htt遺伝子のリピート配列に対して特異的な4種類のgRNAをそれぞれ導入した。その結果、gRNA-s2を導入した群において、10%程度のクローンでリピート配列が遺伝子破壊を伴わずに短縮 (治療) された。治療効果を評価するために、ES細胞から分化誘導した神経細胞を解析したところ、治療群では病状が見られなくなっていた。さらに、治療ES細胞からマウスを復元し個体レベルでも解析したところ、加齢してもハンチントン病が発症しないことが確かめられた。ここまでの結果をまとめて報告済みである(Oura et al. Commun Biol. 2021)。

CRISPR/CAS9系统通过小分子RNA（GRNA）和Cas9核酸酶的复合物切开任何靶DNA。但是，目标序列的下游需要5'-NGG-3'序列，这是对目标序列的约束。近年来，为了实现针对任意序列的遗传修饰，我参与了可以识别5'-NGN-3'并报告为共同作者的修改后的CAS9的发展。因此，在这项研究中，我们使用了这种修饰的CAS9来开发一种修复亨廷顿氏病的热量CAG重复序列的方法，而常规的野生型Cas9无法获得。首先，在ES细胞和受精卵中研究了携带Ng（A/T/C）的目标序列的切割效率（A/T/C）-PAM。结果，在ES细胞中，修饰的Cas9用Ng（A/T/C）-PAM比野生型Cas9更有效地裂解了靶基因组DNA。然而，在受精卵中，即使使用改良的cas9，携带Ng（A/T/C）-PAM的靶基因组DNA几乎不会裂解。随后，从带有亨廷顿氏病的模型小鼠建立了ES细胞，并引入了四种类型的GRNA，每个GRNA都特定于HTT基因的重复序列。结果，在使用GRNA-S2引入的组中，在大约10％的克隆中缩短了重复序列（治疗），而无需任何基因破坏。为了评估治疗的有效性，我们分析了与ES细胞分化的神经元，发现治疗组中未见症状。此外，从治疗的ES细胞中恢复小鼠并在单个水平上进行分析，并确认即使衰老后，亨廷顿氏病也没有发展。到目前为止的结果已在汇编中报道（Oura等人CommunBiol。2021）。

项目成果

KCTD19 and its associated protein ZFP541 are independently essential for meiosis in male mice.

• DOI: 10.1371/journal.pgen.1009412
• 发表时间: 2021-05
• 期刊: PLoS genetics
• 影响因子: 4.5
• 作者: Oura S;Koyano T;Kodera C;Horisawa-Takada Y;Matsuyama M;Ishiguro KI;Ikawa M
• 通讯作者: Ikawa M

Identification of meiosis-required genes using CRISPR/Cas9 and their functional analysis

使用 CRISPR/Cas9 鉴定减数分裂所需基因及其功能分析

• 发表时间: 2021
• 作者: Kim Chang Rok;Noda Taichi;Kim Hyunkyung;Kim Gibeom;Park Seongwan;Na Yongwoo;Oura Seiya;Shimada Keisuke;Bang Injin;Ahn Jun-Yeong;Kim Yong Ryoul;Oh Se Kyu;Choi Hee-Jung;Kim Jong-Seo;Jung Inkyung;Lee Ho;Okada Yuki;Ikawa Masahito;Baek Sung Hee;Seiya Oura
• 通讯作者: Seiya Oura

PHF7 Modulates BRDT Stability and Histone-to-Protamine Exchange during Spermiogenesis

• DOI: 10.1016/j.celrep.2020.107950
• 发表时间: 2020-07-28
• 期刊: CELL REPORTS
• 影响因子: 8.8
• 作者: Kim, Chang Rok;Noda, Taichi;Baek, Sung Hee
• 通讯作者: Baek, Sung Hee

SpCas9-NG mediated genome editing

SpCas9-NG 介导的基因组编辑

• 发表时间: 2020
• 作者: Kim Chang Rok;Noda Taichi;Kim Hyunkyung;Kim Gibeom;Park Seongwan;Na Yongwoo;Oura Seiya;Shimada Keisuke;Bang Injin;Ahn Jun-Yeong;Kim Yong Ryoul;Oh Se Kyu;Choi Hee-Jung;Kim Jong-Seo;Jung Inkyung;Lee Ho;Okada Yuki;Ikawa Masahito;Baek Sung Hee;Seiya Oura;大浦聖矢
• 通讯作者: 大浦聖矢

ARMC12 regulates spatiotemporal mitochondrial dynamics during spermiogenesis and is required for male fertility.

• DOI: 10.1073/pnas.2018355118
• 发表时间: 2021-02-09
• 期刊: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
• 影响因子: 11.1
• 作者: Shimada K;Park S;Miyata H;Yu Z;Morohoshi A;Oura S;Matzuk MM;Ikawa M
• 通讯作者: Ikawa M