遺伝子治療に向けた一塩基編集技術の活用「クラッベ病モデルマウスを用いて」

本研究は、遺伝性脱髄疾患であるクラッベ病のモデル動物として知られているtwitcherマウスに一塩基編集技術を利用し、一塩基多型によってもたらされる疾患の根本的な治療法の開発に向けた基礎研究を行う。昨年度までに、twitcherマウス由来のシュワン細胞株であるTwS1を用いて、ガラクトセロブロシダーゼ（GALC）遺伝子の一塩基変異を修復することができる編集ツールadenine base editors(ABE)を得ることができた。ターゲットとなるアデニンをグアニンへと編集する効率は55.8%であり、近傍の望ましくないアデニンの編集効率は7.7%であった。当該年度では、まず、GALC遺伝子の修復に伴い、生化学的にGALC 酵素活性を測定した。ターゲットのアデニンのみの編集は、編集前と比較して十分な酵素活性の回復が見られた。しかしながら、近傍のアデニンを同時に編集してしまった場合の酵素活性は、正常な酵素活性と比較して低下することが観察された。次に、in vivoでの編集を可能とするために、アデノ随伴ウイルス（AAV）作製用のプラスミドベクターの調整を試みた。AAVに搭載できる遺伝子にはサイズ制限があるため、split intein法（二分割したタンパク質の塩基情報を別々のベクターに組み込み、発現されたタンパク質が再結合することによって元来のタンパク質として機能することができる手法）を用いて、2種類のAAV作製用プラスミドベクターを調整した。作製したプラスミドベクターの編集効果を評価するために、シュワン細胞株TwS1に導入し、編集効率を算出した。その結果、ターゲットとなるアデニンの編集効率は42.0%であり、近傍のアデニンの編集効率は4.9%であった。通常のプラスミドベクターと比較して、やや編集効率の低下が見られたものの、in vivoでの編集に期待できる値であった。

本研究は、遺伝性脱髄疾患であるクラッベ病のモデル動物として知られているtwitcherマウスに一塩基編集技術を利用し、一塩基多型によってもたらされる疾患の根本的な治療法の開発に向けた基礎研究を行う。昨年度までに、twitcherマウス由来のシュワン細胞株であるTwS1を用いて、ガラクトセロブロシダーゼ（GALC）遺伝子の一塩基変異を修復することができる編集ツールadenine base editors(ABE)を得ることができた。ターゲットとなるアデニンをグアニンへと編集する効率は55.8%であり、近傍の望ましくないアデニンの編集効率は7.7%であった。当該年度では、まず、GALC遺伝子の修復に伴い、生化学的にGALC 酵素活性を測定した。ターゲットのアデニンのみの編集は、編集前と比較して十分な酵素活性の回復が見られた。しかしながら、近傍のアデニンを同時に編集してしまった場合の酵素活性は、正常な酵素活性と比較して低下することが観察された。次に、in vivoでの編集を可能とするために、アデノ随伴ウイルス（AAV）作製用のプラスミドベクターの調整を試みた。AAVに搭載できる遺伝子にはサイズ制限があるため、split intein法（二分割したタンパク質の塩基情報を別々のベクターに組み込み、発現されたタンパク質が再結合することによって元来のタンパク質として機能することができる手法）を用いて、2種類のAAV作製用プラスミドベクターを調整した。作製したプラスミドベクターの編集効果を評価するために、シュワン細胞株TwS1に導入し、編集効率を算出した。その結果、ターゲットとなるアデニンの編集効率は42.0%であり、近傍のアデニンの編集効率は4.9%であった。通常のプラスミドベクターと比較して、やや編集効率の低下が見られたものの、in vivoでの編集に期待できる値であった。