遺伝子治療に向けた一塩基編集技術の活用「クラッベ病モデルマウスを用いて」

利用单核苷酸编辑技术进行基因治疗“使用克拉伯病模型小鼠”

• 批准号: 20K07769
• 负责人: 田中 義久
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Osaka Medical and Pharmaceutical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K07769/
• 关键词: クラッベ病; 脱髄疾患; ゲノム編集; CRISPR/Cas9; 一塩基編集

本研究は、遺伝性脱髄疾患であるクラッベ病のモデル動物として知られているtwitcherマウスに一塩基編集技術を利用し、一塩基多型によってもたらされる疾患の根本的な治療法の開発に向けた基礎研究を行う。昨年度までに、twitcherマウス由来のシュワン細胞株であるTwS1を用いて、ガラクトセロブロシダーゼ（GALC）遺伝子の一塩基変異を修復することができる編集ツールadenine base editors(ABE)を得ることができた。ターゲットとなるアデニンをグアニンへと編集する効率は55.8%であり、近傍の望ましくないアデニンの編集効率は7.7%であった。当該年度では、まず、GALC遺伝子の修復に伴い、生化学的にGALC 酵素活性を測定した。ターゲットのアデニンのみの編集は、編集前と比較して十分な酵素活性の回復が見られた。しかしながら、近傍のアデニンを同時に編集してしまった場合の酵素活性は、正常な酵素活性と比較して低下することが観察された。次に、in vivoでの編集を可能とするために、アデノ随伴ウイルス（AAV）作製用のプラスミドベクターの調整を試みた。AAVに搭載できる遺伝子にはサイズ制限があるため、split intein法（二分割したタンパク質の塩基情報を別々のベクターに組み込み、発現されたタンパク質が再結合することによって元来のタンパク質として機能することができる手法）を用いて、2種類のAAV作製用プラスミドベクターを調整した。作製したプラスミドベクターの編集効果を評価するために、シュワン細胞株TwS1に導入し、編集効率を算出した。その結果、ターゲットとなるアデニンの編集効率は42.0%であり、近傍のアデニンの編集効率は4.9%であった。通常のプラスミドベクターと比較して、やや編集効率の低下が見られたものの、in vivoでの編集に期待できる値であった。

In this study, we need to know that there is a fundamental approach to the treatment of sexually transmitted diseases, such as the use of basic techniques, the use of basic techniques, and the fundamental treatment methods for the treatment of twitcher diseases. The reason for this is that last year, the reason for this is that the TwS1 cell line was used for the first time in the year of the year. This is the reason why the TwS1 cell line was used in the last year. This is the reason why the adenine base editors (ABE) cell line has been successfully modified in the first place. The rate of editing sets is 55.8%, and the rate of editing sets is 7.7%. In this year, the GALC enzyme activity of biochemistry was determined by the method of GALC enzyme activity determination. Before editing, the enzyme activity is 10% higher than that before the edit set. At the same time, the enzyme activity, normal enzyme activity and normal enzyme activity were measured. The second, in vivo editing set may have a bad response, and a companion copy (AAV) may be used as an attempt to complete the test. AAV system information system, split intein method (two-part information analysis system, and then combined with the data acquisition system to improve the performance of the machine.) use the information system, the AAV system to use the information system to analyze the system. Make sure that the cell line TwS1 is imported, and the edit set rate is calculated. The results show that the edit set rate is 42.0% and 4.9% respectively. Generally speaking, the edit set rate is low, and the in vivo edit set is expected.