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高効率多目的排出担体創製へ向けた変異型MscLの電気生理、分子動力学的特性解析

突变型 MscL 的电生理学和分子动力学表征，旨在创建高效的多用途外排载体

基本信息

批准号：
19K05785
负责人：
橋本賢一
金额：
$ 2.75万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

メカノセンシティブチャネルは細胞が低浸透圧ストレスに晒された際に開口し、細胞内の低分子化合物を細胞外に排出することで膨圧の上昇に伴う破裂を防ぐ安全弁としての機能を果たすとされている。中でもMscLは他のメカノセンシティブチャネルと比較し高い張力により比較的大きな孔を形成するとされている。微生物発酵においてこのチャネルを排出担体として利用することを考えた場合、制御が困難な低浸透圧ストレスを物質生産のトリガーとして利用することは現実的ではない。このため、通常培養時においても一定確率で開口しうる変異体を見出し、利用する必要がある。しかし、本チャネルは基質特異性が低いため、目的の物質以外にも多くの物質が細胞外にリークしてしまうことが予想される。高効率な物質排出担体の創製のためには、野生型と比較して開口頻度が適度に向上していること、基質特異性の変化に伴う目的物質以外のリークが抑制されることが必要と考えられる。イノシン酸過剰生産を目的に代謝改変された大腸菌にG46D変異型MscLを導入すると、イノシン酸生産量の向上と合わせて生育速度の向上が観察される。これは細胞内に過剰蓄積されたイノシン酸が変異型MscLを介し細胞外へ排出されることで代謝が生育に適した方向へリバランスされたこと、基質特異性の変化により他の化合物のリークが適度に抑制されたことが予想される。Error-Prone PCRにより変異が投入されたと考えられるmscL遺伝子をイノシン酸生合成を強化した大腸菌に導入して培養評価を行ったところ、生育が向上した株を2株取得した。これらはG46D変異体と同様に前述した条件2つを満たしている変異である可能性がある。この変異体の機能解析を進めることにより、物質排出担体としてメカノセンシティブチャネルに要求される特性を明らかにする足がかりとなることが期待される。

The function of the cell is to open the cell at low osmotic pressure, to excrete low molecular weight compounds from the cell, to increase the pressure, to prevent rupture, and to protect the cell from damage. MscL has a high tension and a large hole formation. Microbiological fermentation, production, excretion of support, utilization, control, low permeability, substance production, utilization, and utilization This is usually done with a certain amount of accuracy. In addition to the substance of interest, there are many substances outside the cell. High efficiency, high efficiency, high For the purpose of acid production, E. coli G46D was introduced and the production of acid was increased. The intracellular accumulation of MscL is mediated by the extracellular excretion of MscL, and the metabolism of MscL is mediated by the appropriate direction of reproduction, matrix specific transformation, and moderate inhibition of other compounds. Error-Prone PCR was introduced into the culture of Escherichia coli and two strains were obtained. G46D is the same as the previous condition. The function analysis of the variant is carried out according to the requirements of the substance emission carrier and the characteristics of the substance emission carrier.