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高効率多目的排出担体創製へ向けた変異型MscLの電気生理、分子動力学的特性解析

突变型 MscL 的电生理学和分子动力学表征，旨在创建高效的多用途外排载体

基本信息

批准号：
19K05785
负责人：
橋本賢一
金额：
$ 2.75万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

メカノセンシティブチャネルは細胞が低浸透圧ストレスに晒された際に開口し、細胞内の低分子化合物を細胞外に排出することで膨圧の上昇に伴う破裂を防ぐ安全弁としての機能を果たすとされている。中でもMscLは他のメカノセンシティブチャネルと比較し高い張力により比較的大きな孔を形成するとされている。微生物発酵においてこのチャネルを排出担体として利用することを考えた場合、制御が困難な低浸透圧ストレスを物質生産のトリガーとして利用することは現実的ではない。このため、通常培養時においても一定確率で開口しうる変異体を見出し、利用する必要がある。しかし、本チャネルは基質特異性が低いため、目的の物質以外にも多くの物質が細胞外にリークしてしまうことが予想される。高効率な物質排出担体の創製のためには、野生型と比較して開口頻度が適度に向上していること、基質特異性の変化に伴う目的物質以外のリークが抑制されることが必要と考えられる。イノシン酸過剰生産を目的に代謝改変された大腸菌にG46D変異型MscLを導入すると、イノシン酸生産量の向上と合わせて生育速度の向上が観察される。これは細胞内に過剰蓄積されたイノシン酸が変異型MscLを介し細胞外へ排出されることで代謝が生育に適した方向へリバランスされたこと、基質特異性の変化により他の化合物のリークが適度に抑制されたことが予想される。Error-Prone PCRにより変異が投入されたと考えられるmscL遺伝子をイノシン酸生合成を強化した大腸菌に導入して培養評価を行ったところ、生育が向上した株を2株取得した。これらはG46D変異体と同様に前述した条件2つを満たしている変異である可能性がある。この変異体の機能解析を進めることにより、物質排出担体としてメカノセンシティブチャネルに要求される特性を明らかにする足がかりとなることが期待される。

メカノセンシティブチャネルは Low permeability pressure in cells, low molecular weight compounds in cells The substance is discharged from the extracellular space and the pressure rises and is accompanied by rupture and prevention.中でもMscLはhis のメカノセンシティブチャネルと comparatively high いtension により comparative large きなpore をform するとされている. Microbial fermentation, removal of carriers, use of microorganisms, control of occasions, and control of fermentation It is difficult to use low permeability pressure material to produce low-permeability materials.このため、Normally, when cultivating, there is a certain degree of accuracy. でOpening しうる変variant をSee out し、Use するNecessary がある.しかし, this チャネルは matrix specificity がいため, the target のsubstance other than the にも多くのsubstance が extracellular にリークしてしまうことが yu want される. High-efficiency substance discharge carrier is created, wild type is compared, the frequency of opening is moderate, and it is upward.こと、Matrix-specific modification is necessary and must be suppressed by substances other than the target substance. The purpose of イノシン acid peroxide production is to modify the metabolism of Escherichia coli G46D allotype MscL Import すると, イノシンacid production volume のUP と合わせて Birth speed のUP が観看される.これは Intracellular excess accumulation されたイノシン acid が変 Isotype MscL を mediated し Extracellular excretion されることでMetabolism が Fertility に Adaptable したThe direction is へリバランスされたこと, the matrix-specific の変化によりhis の compound のリークがmoderate にinhibition されたことが yu want される. Error-Prone PCRにより変isoが inputされたとKaoえられるmscL伝子をイノシンacidogensyntheticをstrong The culture of coliform bacteria was introduced, the culture was evaluated, and the growth and growth of 2 strains were obtained. The G46D variant is the same as the one mentioned above and the condition 2 is the same as the possibility of the variant.この変different body's functional analysis を入めることにより、substance discharge carrier としてメカノセンシティブチャネルにRequirementされるCharacteristicsを明らかにする FootがかりとなることがLooking forward to される.