Notch受容体の細胞表面における活性化調節機構

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TM2D3のN側の細胞外ドメイン全長（102残基）を6 × His融合タンパク質（組換え型TM2D3タンパク質）として大腸菌を用いて発現した。このタンパク質のrefoldingを試みたところ、非還元状態で二量体および三量体を形成することを見いだした。これらの複合体は還元状態にしても部分的にしか崩壊しないことから、安定なものであることが示唆された。この組換え型TM2D3タンパク質を抗原としてウサギポリクローナル抗体を作製した。この抗体を用いてWestern blottingをおこなったところ、組換え型TM2D3タンパク質二量体および三量体は1 ngのオーダーに至るまで良好に検出されたが、単量体の検出には10倍量のタンパク質を必要とした。野生型マウス由来の初代培養線維芽細胞の溶解液を、Tm2d3ノックアウトマウス由来細胞の溶解液をコントロールとして同様の解析を行ったところ、両者のバンドのパターンに変化が見られなかったことから、この抗体では内因性Tm2d3タンパク質の検出は難しいと考えられた。NOTCH1とTM2D3の物理的会合を検討するため、NOTCH1を過剰発現させた293T細胞の溶解液と組換え型TM2D3タンパク質をincubateし、上記抗体とprotein G sepharoseを用いてTM2D3を回収したが、NOTCH1のpull downは検出されなかった。TM2D3と類似した構造を持つタンパク質であるTM2D1とTM2D2について、N側の細胞外ドメイン全長の大腸菌を用いた発現を試み、81残基からなるTM2D1、N端が異なる2つのalternative splicing variantが知られているTM2D2については112残基からなるTM2D2v1と86残基からなるTM2D2v2それぞれを6 × His融合タンパク質として発現することに成功した。