STORM顕微鏡を用いた有毛細胞シナプスにおけるOtoferlinの構造機能解析

点击翻译按钮获取中文摘要

内有毛細胞と蝸牛神経を繋ぐ求心性シナプス（内有毛細胞リボンシナプス）において神経伝達物質としてグルタミン酸が用いられており、この部位の障害によりオーディトリーニューロパチーが引き起こされる。本研究では電気生理学的手法であるパッチクランプ法に光学的手法である超解像イメージングとグルタミン酸イメージングを組み合わせ、OtoferlinをコードするOTOFの遺伝子変異による難聴の病態解明を目指す。以下に令和4年度の研究実績を記す。(1) グルタミン酸イメージングによる機能解析内有毛細胞リボンシナプスにおけるグルタミン酸放出を測定するための新規ツールとして蛍光グルタミン酸プローブを用いているが、内有毛細胞との結合能が高くないため、秒単位の時間分解能しか得られていない。令和2-3年度に内有毛細胞と同様のリボンシナプス構造を有する網膜双極細胞を用いてリボンシナプス用にプローブをカスタマイズし、ミリ秒単位でのグルタミン酸放出の時空間動態の解析を可能とした。令和4年度は、キンギョ網膜双極細胞軸索終末部を対象としてCtBP/Ribeye結合ペプチドによりリボンを標識した上で、蛍光カルシウム色素によるカルシウムイメージング、蛍光グルタミン酸色素によるグルタミン酸イメージングの同時記録を実現し、神経伝達の鍵となるカルシウム流入とグルタミン酸放出の時空間動態をリボンとの距離と関連付けながら解析することを可能とした。このような状況の中、野生型マウス蝸牛から単離した内有毛細胞を対象としてグルタミン酸イメージングを試みているが、満足のいく結果には至っていない。(2) 免疫染色法による構造解析令和4年度は論文投稿に向けて上記イメージング実験に注力したため、免疫染色法による構造解析を実施し得なかった。