免疫細胞の分化と老化における活性酸素の機能の解明

活性酸素は生体内への過剰な蓄積により、老化や様々な疾患の原因となる有害物質である。一方で免疫応答時には、免疫細胞が産生した活性酸素が、免疫細胞の活性化や分化におけるシグナル伝達物質として作用することが知られている。我々は生体内の酸化ストレスを可視化して定量評価できるEF-1a promoter/roGFP Tgマウスを開発し、in vivoで細胞内の酸化ストレスの発生と除去をリアルタイムでモニタリングできる実験系を立ち上げた(Wolf,Nishimaki,J.Invest.Dermatol.,2014)。次にリンパ組織や免疫細胞における酸化還元状態をモニタリングするために、promoterを変えて、CAG promoter/roGFP Tgマウスを作製した（未発表）。このCAG/roGFP Tgマウスを用いて、以下の実験を行った。１．固定法の検討：roGFPタンパク質は、酸化還元状態により立体構造が変化し、405nmと480nmの励起波長による蛍光強度の比率が変化する。フローサイトメーターを用いて解析を行うために、CAG/roGFP Tgマウスの脾臓から単離した免疫細胞のroGFPタンパク質の立体構造が変化しない固定法を検討した。単離された免疫細胞は速やかに100mM N-エチルマレイミド(NEM)/PBS 4℃ 10minで処理し、続いて４％PFA/NEM/PBS室温15minで固定する。この方法で固定した免疫細胞はin vivoで測定した脾臓の405/480nmの蛍光強度の比率を保持していた。２．フローサイトメーターを用いた測定系の検討：CAG/roGFP Tgマウスの脾臓から単離した免疫細胞を上記の条件で固定した後、CD45, NK1.1, B220, CD4, CD8等の細胞表面標識抗体で染色しフローサイトメーターで解析した。T細胞、B細胞、樹状細胞、マクロファージなどの各免疫担当細胞に分けてroGFPの酸化還元状態が測定できるパネルを構築した。これにより各免疫担当細胞に分けて、刺激応答時の酸化ストレスを解析可能な測定系が構築できた。

活性酸素は生体内への過剰な蓄積により、老化や様々な疾患の原因となる有害物質である。一方で免疫応答時には、免疫細胞が産生した活性酸素が、免疫細胞の活性化や分化におけるシグナル伝達物質として作用することが知られている。我々は生体内の酸化ストレスを可視化して定量評価できるEF-1a promoter/roGFP Tgマウスを開発し、in vivoで細胞内の酸化ストレスの発生と除去をリアルタイムでモニタリングできる実験系を立ち上げた(Wolf,Nishimaki,J.Invest.Dermatol.,2014)。次にリンパ組織や免疫細胞における酸化還元状態をモニタリングするために、promoterを変えて、CAG promoter/roGFP Tgマウスを作製した（未発表）。このCAG/roGFP Tgマウスを用いて、以下の実験を行った。１．固定法の検討：roGFPタンパク質は、酸化還元状態により立体構造が変化し、405nmと480nmの励起波長による蛍光強度の比率が変化する。フローサイトメーターを用いて解析を行うために、CAG/roGFP Tgマウスの脾臓から単離した免疫細胞のroGFPタンパク質の立体構造が変化しない固定法を検討した。単離された免疫細胞は速やかに100mM N-エチルマレイミド(NEM)/PBS 4℃ 10minで処理し、続いて４％PFA/NEM/PBS室温15minで固定する。この方法で固定した免疫細胞はin vivoで測定した脾臓の405/480nmの蛍光強度の比率を保持していた。２．フローサイトメーターを用いた測定系の検討：CAG/roGFP Tgマウスの脾臓から単離した免疫細胞を上記の条件で固定した後、CD45, NK1.1, B220, CD4, CD8等の細胞表面標識抗体で染色しフローサイトメーターで解析した。T細胞、B細胞、樹状細胞、マクロファージなどの各免疫担当細胞に分けてroGFPの酸化還元状態が測定できるパネルを構築した。これにより各免疫担当細胞に分けて、刺激応答時の酸化ストレスを解析可能な測定系が構築できた。