生体内遊離ヘムの計測と細胞内イメージング

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ヘムは生体に必須の色素であり，一部のヘムは細胞内で遊離ヘムとして存在する。遊離ヘムは生体に様々な影響を与えることが知られており，高濃度域では疾患の原因となることが明らかにされている。これまでに，ヘム分解系酵素であるヘムオキシゲナーゼ1（HO1）とNADPHシトクロムP450還元酵素のopen型変異体（ΔTGEE）にそれぞれ緑色蛍光蛋白質の変異体である青色蛍光蛋白質（CFP）と黄色蛍光蛋白質（YFP）を修飾した，蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）に基づく一分子型バイオセンサーCFP-HO1-ΔTGEE-YFPを開発した。このセンサーでは，HO1に結合したヘムにCFPの蛍光エネルギーが吸収される可能性があること，蛋白質間相互作用によらないFRETが生じている可能性があること，分子量が大きく可溶化しにくいことが問題であった。今年度は，これらの課題を解決するためにCFPとYFPの修飾位置を交換し，さらにHO1-ΔTGEE間のリンカーを欠損させた二分子型FRETバイオセンサーYFP-HO1/ΔTGEE-CFPを開発することとした。YFP-HO1およびΔTGEE-CFPをそれぞれ大腸菌発現系を用いて発現・単離した。50 nMのYFP-HO1とΔTGEE-CFPの混合溶液にCFPの励起光（385 nm）を照射し，ヘムを0から75 nMまで添加しながら蛍光スペクトルを測定したところ，YFPの蛍光（525 nm）の上昇が見られ，FRETが観測された。ヘム濃度に対しFRETシグナルの強度変化をプロットした結合曲線より，2.2 nMの解離定数が算出された。また，沈降平衡法を用いた超遠心分析により，ヘム結合型YFP-HO1とΔTGEE-CFPが複合体を形成することが確認された。これらのことより，YFP-HO1とΔTGEE-CFPは，二分子間FRETヘムセンサーとして機能することが示された。