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生体内遊離ヘムの計測と細胞内イメージング

体内游离血红素测量和细胞内成像

基本信息

批准号：
18K05358
负责人：
坂本寛
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Kyushu Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18K05358/
关键词：
ヘムセンサープローブ FRET イメージング酵素ケミカルバイオロジー

项目摘要

ヘムは生体に必須の色素であり，一部のヘムは細胞内で遊離ヘムとして存在する。遊離ヘムは生体に様々な影響を与えることが知られており，高濃度域では疾患の原因となることが明らかにされている。これまでに，ヘム分解系酵素であるヘムオキシゲナーゼ1（HO1）とNADPHシトクロムP450還元酵素のopen型変異体（ΔTGEE）にそれぞれ緑色蛍光蛋白質の変異体である青色蛍光蛋白質（CFP）と黄色蛍光蛋白質（YFP）を修飾した，蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）に基づく一分子型バイオセンサーCFP-HO1-ΔTGEE-YFPを開発した。このセンサーでは，HO1に結合したヘムにCFPの蛍光エネルギーが吸収される可能性があること，蛋白質間相互作用によらないFRETが生じている可能性があること，分子量が大きく可溶化しにくいことが問題であった。今年度は，これらの課題を解決するためにCFPとYFPの修飾位置を交換し，さらにHO1-ΔTGEE間のリンカーを欠損させた二分子型FRETバイオセンサーYFP-HO1/ΔTGEE-CFPを開発することとした。YFP-HO1およびΔTGEE-CFPをそれぞれ大腸菌発現系を用いて発現・単離した。50 nMのYFP-HO1とΔTGEE-CFPの混合溶液にCFPの励起光（385 nm）を照射し，ヘムを0から75 nMまで添加しながら蛍光スペクトルを測定したところ，YFPの蛍光（525 nm）の上昇が見られ，FRETが観測された。ヘム濃度に対しFRETシグナルの強度変化をプロットした結合曲線より，2.2 nMの解離定数が算出された。また，沈降平衡法を用いた超遠心分析により，ヘム結合型YFP-HO1とΔTGEE-CFPが複合体を形成することが確認された。これらのことより，YFP-HO1とΔTGEE-CFPは，二分子間FRETヘムセンサーとして機能することが示された。

Some of the pigments necessary for living organisms are free in the cells. The effect of free radicals on organisms is known, and the cause of diseases in high concentrations is known. In this case, the open type variant (ΔTGEE) of the catabolizing enzyme is the green fluorescent protein variant (CFP), the yellow fluorescent protein (YFP) is the modified version, and the fluorescent resonance shift (FRET) is the basic molecular type variant (CFP-HO1-ΔTGEE-YFP). For example, the possibility of binding between HO1 and CFP is higher than that of binding between HO1 and CFP, and the possibility of binding between HO 1 and CFP is higher than that of binding between HO 1 and CFP. This year, the problem of CFP and YFP modification position is solved, and the problem of HO1-Δ TGEE is solved. YFP-HO1 and Δ TGE-CFP are used in the development of E. coli. When CFP excitation (385 nm) was irradiated with 50 nM YFP-HO1 and ΔTGEE-CFP mixed solution, the increase of fluorescence (525 nm) of YFP was observed and FRET was measured from 0 to 75 nM. The dissociation constant of 2.2 nM was calculated from the binding curve of FRET concentration. The sedimentation equilibrium method was used to confirm the formation of YFP-HO1 and Δ TGE-CFP complexes. YFP-HO1 and Δ TGE-CFP are the two components of FRET.