Die TIMP-1/MMP-9-Interaktion: Struktur/Funktionsanalysen in vitro und am Tiermodell akuter und chronisch fibrosierender Erkrankungen

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Der Tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1) spielt bei der Entwicklung und Progression der hepatischen Fibrose eine wichtige funktionelle Rolle. Da TIMP-1 kausal mit der Fibrogenese assoziiert ist und während der spontanen Fibrolyse eine verminderte TIMP-1 Expression beobachtet wurde, war unser Ziel eine spezifische Antagonisierung von TIMP-1 zur Reduktion der hepatischen Fibrose. TIMP-1 und MMP-9 bilden einen Komplex, der sich durch sehr hohe Bindungsaffinität auszeichnet. Durch rationale Mutagenese der MMP-9 gelang uns die Konstruktion von TIMP-1 Antagonisten (MMP-9H401A, MMP-9E402Q, MMP-9E402H/H411E), die enzymatisch nicht aktiv sind, weiterhin fest an TIMP-1 binden und in vitro die TIMP-1 Aktivität hemmen. Im Tetrachlorkohlenstoff induzierten Fibrosemodell führen MMP-9H401A und MMP-9E402Q nach adenoviraler Überexpression zu einer signifikanten Hemmung der Leber3 fibrose. Wir möchten diesen gentherapeutischen Ansatz auf ein nicht toxisches Fibrosemodell, die Abcb4-Knockout-Maus, übertragen. Die hepatische Fibrogenese der Abcb4-/- Maus ähnelt histologisch der humanen primär sklerosierenden Cholangitis. Außerdem soll geklärt werden, ob eine Kombination der TIMP-1-Antagonisten mit weiteren antifibrotischen Ansätzen (Smad7; anti-TGFβ) zur additiven oder synergistischen Fibrosehemmung in unterschiedlichen Mausmodellen führt (CCl4, Abcb4-/-, Cholestase, Thioacetamid (TAA)). Wir konnten zeigen, dass die Wirkung der TIMP-1 Antagonisten zu einer Apoptose der hepatischen Sternzellen (HSC) führt. Der genaue Mechanismus (Rezeptoren? Caspasen?) soll an HSC Primärkulturen und verschiedenen Mausfibrosemodellen untersucht werden. Mit Hilfe der Laser Scanning Mikroskopie (LSM) und des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers gelang der Nachweis einer intrazellulären Komplexbildung von TIMP-1 und MMP-9. Die Bedeutung dieser Komplexbildung für die Synthesefunktion der Zellen, insbesondere für die Glykosylierung und den Grad der Prozessierung von MMP-9, die MMP-9/TIMP-1 Komplexaktivierung durch andere MMPs, sowie die Co- Lokalisation von MMP-9 mit CD44 und TGFβ sollen an zellbiolgischen Studien unter Verwendung eines proteomischen Ansatzes (2D-Gelelektrophorese, Difference in Gel Electrophoresis) sowie der LSM geklärt werden. Aus dem Vergleich der zellbiologischen Befunde für MMP-9 mit denen für die MMP-9-mut erwarten wir Hinweise auf die intrazelluläre und membranassoziierte Funktion der TIMP-1/MMP-9-Interaktion sowie auf Möglichkeiten der gezielten Intervention.