Die TIMP-1/MMP-9-Interaktion: Struktur/Funktionsanalysen in vitro und am Tiermodell akuter und chronisch fibrosierender Erkrankungen

金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）在肝纤维化的发生、发展中具有重要作用。TIMP-1与肝纤维化的相关性研究表明，TIMP-1的表达与肝纤维化的发生有关，而TIMP-1对肝纤维化的抑制作用是特异性的。TIMP-1和MMP-9产生一种复合物，这种复合物在结合初始化时也是如此。MMP-9的诱变原理是通过构建TIMP-1拮抗剂（MMP-9 H401 A、MMP-9 E402 Q、MMP-9 E402 H/H411 E），使酶不活化，从而在体外与TIMP-1结合并活化TIMP-1。四氯kohlenstoff诱导MMP-9 H401 A和MMP-9 E402 Q的纤维化细胞表达腺病毒，以形成Leber 3纤维化的显著血管。我们希望通过基因治疗来预防一种没有毒性的纤维蛋白，即Abcb 4基因敲除小鼠。Abcb 4-/- Maus的肝纤维化是人类原发性胆管炎的组织学表现。我们将TIMP-1-拮抗剂与抗纤维化药物Smad 7（抗TGF β）联合应用于非干扰性的小鼠模型（CCl 4、Abcb 4-/-、Cholestase、Thioacetamid（TAA））中，以获得良好的韦尔登。我们知道TIMP-1拮抗剂对肝硬化（HSC）凋亡的作用。Der genaue Mechanismus（Rezeptoren？卡斯帕森？）soll an HSC Primärkulturen und versedenen Mausfibrosemodellen untersucht韦尔登. Mit Hilfe der Laser Scanning Mikroskopie（LSM）und des Escherzenz-Resonanz-Energie-Transfers gelang der Nachweis einer intrazellulären Komplexbildung von TIMP-1 und MMP-9.本研究通过对MMP-9的糖基化和MMP-9/TIMP-1复合体的研究，探讨了MMP-9与CD 44和TGFβ的共定位和Zellen合成功能的复合体，并通过LSM的蛋白质组学分析（2D凝胶电泳，Difference in Gel韦尔登）进行了验证。通过对MMP-9的细胞生物学研究，我们发现TIMP-1/MMP-9的细胞内和膜内相互作用可能会影响MMP-9的表达。

Der Tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1) spielt bei der Entwicklung und Progression der hepatischen Fibrose eine wichtige funktionelle Rolle. Da TIMP-1 kausal mit der Fibrogenese assoziiert ist und während der spontanen Fibrolyse eine verminderte TIMP-1 Expression beobachtet wurde, war unser Ziel eine spezifische Antagonisierung von TIMP-1 zur Reduktion der hepatischen Fibrose. TIMP-1 und MMP-9 bilden einen Komplex, der sich durch sehr hohe Bindungsaffinität auszeichnet. Durch rationale Mutagenese der MMP-9 gelang uns die Konstruktion von TIMP-1 Antagonisten (MMP-9H401A, MMP-9E402Q, MMP-9E402H/H411E), die enzymatisch nicht aktiv sind, weiterhin fest an TIMP-1 binden und in vitro die TIMP-1 Aktivität hemmen. Im Tetrachlorkohlenstoff induzierten Fibrosemodell führen MMP-9H401A und MMP-9E402Q nach adenoviraler Überexpression zu einer signifikanten Hemmung der Leber3 fibrose. Wir möchten diesen gentherapeutischen Ansatz auf ein nicht toxisches Fibrosemodell, die Abcb4-Knockout-Maus, übertragen. Die hepatische Fibrogenese der Abcb4-/- Maus ähnelt histologisch der humanen primär sklerosierenden Cholangitis. Außerdem soll geklärt werden, ob eine Kombination der TIMP-1-Antagonisten mit weiteren antifibrotischen Ansätzen (Smad7; anti-TGFβ) zur additiven oder synergistischen Fibrosehemmung in unterschiedlichen Mausmodellen führt (CCl4, Abcb4-/-, Cholestase, Thioacetamid (TAA)). Wir konnten zeigen, dass die Wirkung der TIMP-1 Antagonisten zu einer Apoptose der hepatischen Sternzellen (HSC) führt. Der genaue Mechanismus (Rezeptoren? Caspasen?) soll an HSC Primärkulturen und verschiedenen Mausfibrosemodellen untersucht werden. Mit Hilfe der Laser Scanning Mikroskopie (LSM) und des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers gelang der Nachweis einer intrazellulären Komplexbildung von TIMP-1 und MMP-9. Die Bedeutung dieser Komplexbildung für die Synthesefunktion der Zellen, insbesondere für die Glykosylierung und den Grad der Prozessierung von MMP-9, die MMP-9/TIMP-1 Komplexaktivierung durch andere MMPs, sowie die Co- Lokalisation von MMP-9 mit CD44 und TGFβ sollen an zellbiolgischen Studien unter Verwendung eines proteomischen Ansatzes (2D-Gelelektrophorese, Difference in Gel Electrophoresis) sowie der LSM geklärt werden. Aus dem Vergleich der zellbiologischen Befunde für MMP-9 mit denen für die MMP-9-mut erwarten wir Hinweise auf die intrazelluläre und membranassoziierte Funktion der TIMP-1/MMP-9-Interaktion sowie auf Möglichkeiten der gezielten Intervention.