Exploreing and identification of thermosensing-module that involves in thermoregulation of skunk cabbage.

臭甘蓝温度调节热传感模块的探索与鉴定

基本信息

批准号：
19H02918
负责人：
伊藤菊一
金额：
$ 10.98万
依托单位：
Iwate University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

ザゼンソウは早春の寒冷環境で発熱し、外気温の変動にも関わらずその熱産生器官である肉穂花序と呼ばれる花器の温度を23°C程度に維持できる恒温性を有している。本年度の研究においてはザゼンソウの肉穂花序温度を人為的に変化させたサンプルを対象に、RNA-seqによる転写産物の網羅的な解析を行った。その結果、温度低下時の発熱組織において顕著に発現が増大する遺伝子としてホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼキナーゼ（PEPC kinase）を見出した。PEPC kinaseはホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（PEPC）をリン酸化し、活性化させることが知られている酵素である。PEPCはミトコンドリアにおけるTCA回路に基質を供給する主要な酵素であり、PEPCのリン酸化による活性調節は本植物の呼吸制御に密接に関わることが予想された。そこで、PEPC kinaseをコードする遺伝子の転写産物の詳細な発現をqRT-PCRにより解析したところ、当該転写産物が発熱組織特異的に発現していることが判明した。さらに、ザゼンソウPEPC kinaseを組換えタンパク質として大腸菌で発現させ、ほぼ単一バンドとして精製することに成功した。一方、PEPC kinaseの基質であるPEPCについては、ザゼンソウ発熱組織抽出物から単一バンドまで精製し、nano LC-MS/MS解析により得られたタンパク質がPEPCのペプチド断片を含むことを確認した。さらに、精製により得られたPEPC標品を基質にPEPC kinaseを用いた試験管内リン酸化反応を行った結果、反応時間に応じたPEPCのリン酸化が観察され、精製したPEPC kinaseがリン酸化活性を有していることが判明した。また、発熱期のザゼンソウ肉穂花序から得られた抽出液に存在するPEPCのリン酸化の状態を解析したところ、その一部がリン酸化されていることを示す結果が得られた。これらの結果は、ザゼンソウ肉穂花序における恒温性メカニズムにPEPCのリン酸化が関与している可能性を示すものである。

沙丁鱼在早春的寒冷环境中产生热量，并具有允许运河的温度（称为海绵为热器官）的温度，将其保持在大约23°C的左右，约23°C。在今年的研究中，对使用RNA-seq进行的转录本的全面分析是对嗅探海绵的人为变化的样品进行的。结果，发现磷酸烯醇丙酮酸羧化酶激酶（PEPC激酶）是一种基因，当温度降低时，在发烧延伸组织中的表达显着增加。 PEPC激酶是一种已知的酶，可磷酸化并激活磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPC）。 PEPC是为线粒体中TCA循环提供底物的主要酶，并且可以预期，通过PEPC磷酸化对活性调节与植物中的呼吸控制密切相关。因此，通过QRT-PCR分析了编码PEPC激酶基因的转录本的详细表达，发现转录本在发烧组织中特别表达。此外，PEPC激酶在大肠杆菌中以重组蛋白的形式表达，并成功地纯化为几乎单个带。另一方面，PEPC是一种PEPC激酶的底物，从Zezensou的加热组织提取物中纯化了PEPC，并确认通过Nano LC-MS/MS分析获得的蛋白质包含PEPC的肽片段。此外，通过纯化获得的PEPC制剂用作底物使用PEPC激酶在体外磷酸化反应进行体外磷酸化反应，并根据反应时间观察PEPC的磷酸化，并发现纯化的pepc激酶具有磷酸化活性。此外，在分析发烧阶段从海绵中获得的提取物中存在的PEPC的磷酸化状态时，我们发现该提取物的一部分被磷酸化。这些结果表明，PEPC磷酸化可能与蜘蛛网花序中的主流机理有关。