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Exploreing and identification of thermosensing-module that involves in thermoregulation of skunk cabbage.

臭甘蓝温度调节热传感模块的探索与鉴定

基本信息

批准号：
19H02918
负责人：
伊藤菊一
金额：
$ 10.98万
依托单位：
Iwate University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

ザゼンソウは早春の寒冷環境で発熱し、外気温の変動にも関わらずその熱産生器官である肉穂花序と呼ばれる花器の温度を23°C程度に維持できる恒温性を有している。本年度の研究においてはザゼンソウの肉穂花序温度を人為的に変化させたサンプルを対象に、RNA-seqによる転写産物の網羅的な解析を行った。その結果、温度低下時の発熱組織において顕著に発現が増大する遺伝子としてホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼキナーゼ（PEPC kinase）を見出した。PEPC kinaseはホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（PEPC）をリン酸化し、活性化させることが知られている酵素である。PEPCはミトコンドリアにおけるTCA回路に基質を供給する主要な酵素であり、PEPCのリン酸化による活性調節は本植物の呼吸制御に密接に関わることが予想された。そこで、PEPC kinaseをコードする遺伝子の転写産物の詳細な発現をqRT-PCRにより解析したところ、当該転写産物が発熱組織特異的に発現していることが判明した。さらに、ザゼンソウPEPC kinaseを組換えタンパク質として大腸菌で発現させ、ほぼ単一バンドとして精製することに成功した。一方、PEPC kinaseの基質であるPEPCについては、ザゼンソウ発熱組織抽出物から単一バンドまで精製し、nano LC-MS/MS解析により得られたタンパク質がPEPCのペプチド断片を含むことを確認した。さらに、精製により得られたPEPC標品を基質にPEPC kinaseを用いた試験管内リン酸化反応を行った結果、反応時間に応じたPEPCのリン酸化が観察され、精製したPEPC kinaseがリン酸化活性を有していることが判明した。また、発熱期のザゼンソウ肉穂花序から得られた抽出液に存在するPEPCのリン酸化の状態を解析したところ、その一部がリン酸化されていることを示す結果が得られた。これらの結果は、ザゼンソウ肉穂花序における恒温性メカニズムにPEPCのリン酸化が関与している可能性を示すものである。

The temperature of the flower organ is maintained at 23°C due to the cold environment in early spring, and the temperature of the flower organ is maintained at 23°C. This year's study was conducted to analyze the effects of artificial changes in inflorescence temperature, RNA-seq, and the results of the study. As a result, the heat transfer tissue appears to increase when the temperature is low, and PEPC kinase appears to increase. PEPC kinase is active and active. PEPC is involved in the regulation of plant respiration through the regulation of enzyme activity in the TCA loop. QRT-PCR was used to analyze the expression of PEPC kinase gene and to identify the specific expression of PEPC kinase gene. In addition, the PEPC kinase was successfully synthesized and purified from Escherichia coli. The PEPC kinase matrix was purified and analyzed by nano LC-MS/MS to confirm the PEPC kinase fragment. PEPC kinase is used to detect and refine the activity of PEPC in the reaction tube. The analysis of the acidification state of PEPC during the development period and the analysis of the acidification state of PEPC during the development period were carried out. The results showed that the thermostability of PEPC and the possibility of its acidification were not obvious.