Ｂｔ毒素の進化を模倣した、殺虫タンパク質の人為的改変

人工修饰杀虫蛋白以模仿 Bt 毒素的进化

• 批准号: 17J01066
• 负责人: 阿出川 さとみ
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2017-04-26 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17J01066/
• 关键词: Bacillus thuringiensis; Bt毒素; ABC transporter; タンパク質工学; Cry毒素; ABCトランスポーター; 受容体探索

1.Bt毒素新規受容体探索系の改良：Cry1Aaの受容体カドヘリン様タンパク質を初めて、また高いLC-MS/MSスコアで検出できた。これは今までで一番Cry1Aa毒素に結合する膜タンパク質を高濃度に濃縮できたことを意味していたが、それでもABC transporter C2 (ABCC2) は検出できなかった。ABCC2がカイコガ中腸においてカドヘリン様タンパク質よりさらに10倍低い発現量を示すためだと考えられ、より高濃度にABCC2を濃縮する手法が必要だと分かった。2.Bt毒素の潜在的なABC transporter利用能力：カイコガ中腸に発現する55種類のABC transporter のうち、6種類のABC transporterとカイコガを殺せる5種類のBt毒素を題材に、Bt毒素が受容体として利用できるABC transporterがどれほどあるかを解析した。その結果、1種類のBt毒素がその強弱はありながらも複数のABC transporterを受容体として利用できることが示された。3.ABCC2との結合に重要なBt毒素上のアミノ酸残基の解析：カイコガのABCC2 (BmABCC2) に対する結合親和性が低いCry1DaとCry9Daにおいて、ドメインIIのループ2の根元の領域ごとBmABCC2を受容体として利用できるCry1Aaのものにすげ替えたところ、BmABCC2に対する結合親和性が向上した。これは異なる毒素の種類を超えて、この領域がABCC2との結合に重要であることを意味しており、Bt毒素の人為的改変のための変異導入部位が明確となった。4.タンパク質工学の実施：前年度からさらに改良を重ねた実験条件で、Cry1Aa毒素の変異体ファージライブラリーを用いてBmABCC2に対してパニング選抜実験を試みたところ、数種類の変異体Cry1Aaが濃縮、すなわち選抜された。

1。首先以高LC-MS/MS评分检测到BT毒素的新型受体搜索系统：CRY1AA受体钙粘蛋白样蛋白。这意味着与CRY1AA毒素结合的膜蛋白是有史以来最集中的，但是无法检测到ABC转运蛋白C2（ABCC2）。这被认为是因为ABCC2在蚕飞蛾的中肠中表达，比钙粘蛋白样蛋白低10倍，并且发现需要在较高浓度下富集ABCC2的方法。 2。BT毒素的潜在ABC转运蛋白利用能力：在蚕飞蛾中肠中表达的55种ABC转运蛋白中，我们分析了多少ABC转运蛋白可以使用BT毒素作为受体，基于六种ABC转运蛋白和5个可以杀死丝虫moths的BT毒素。结果表明，尽管有强度，但一种类型的BT毒素仍可以利用多个ABC转运蛋白作为受体。 3。对BT毒素上氨基酸残基的分析对于与ABCC2结合至关重要的氨基酸残基：在CRY1DA和CRY9DA中，对ABCC2（BMABCC2）的结合亲和力较低，BMABCC2被CRY1AA替换为CRY1AA，可以用作domain II的每个区域的受体，可用作一个受体，在domain ii in II中的每个区域都可以使用BMACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC。这意味着除了不同的毒素类型之外，该区域对于与ABCC2的结合很重要，并且已经阐明了BT毒素的人工修饰的诱变位点。 4。蛋白质工程的实施：在实验条件下，自上一年以来，我们尝试使用Cry1aa毒素的突变噬菌体库进行Panning Selection Selection实验，而CRY1AA的几种变体富含，即选择。

项目成果

Receptor analysis of Cry1Ca toxin expressed on Sf9 cells, oral presentation

Sf9 细胞上表达的 Cry1Ca 毒素的受体分析，口服介绍

• 发表时间: 2019
• 作者: Endo;H.;Tanaka;S.;Imamura;K.;Adegawa;S.;Kikuta;S. & Sato;R.;阿出川 さとみ;○Adegawa Satomi & Sato Ryoichi
• 通讯作者: ○Adegawa Satomi & Sato Ryoichi

カイコ ABC トランスポーターの細胞外ループ構造は Cry 毒素に対する感受性を決定する

家蚕ABC转运蛋白的细胞外环结构决定对Cry毒素的敏感性

• 发表时间: 2017
• 作者: 〇横手翔太;王永浩;金承元;阿出川さとみ;佐藤令一;○阿出川 さとみ・山口奈緒美・佐藤令一;○遠藤悠・田中詩穂・阿出川さとみ・佐藤令一
• 通讯作者: ○遠藤悠・田中詩穂・阿出川さとみ・佐藤令一

受容体ABCトランスポーターへの結合に寄与するCry毒素ドメインIIのループ根元領域

Cry 毒素结构域 II 的环碱基区域有助于与受体 ABC 转运蛋白结合

• 发表时间: 2018
• 作者: 〇阿出川さとみ;佐藤令一
• 通讯作者: 佐藤令一

The intracellular region of the Bombyx mori cadherin-like protein is not necessary to mediate cytotoxicity of Cry1A toxins.

家蚕钙粘蛋白样蛋白的细胞内区域对于介导 Cry1A 毒素的细胞毒性不是必需的。

• 发表时间: 2017
• 作者: Endo;H.;○Adegawa;S.;& Sato;R.
• 通讯作者: R.

ATP-Binding Cassette Subfamily a Member 2 Is a Functional Receptor for Bacillus thuringiensis Cry2A Toxins in Bombyx mori, But Not for Cry1A, Cry1C, Cry1D, Cry1F, or Cry9A Toxins

• DOI: 10.3390/toxins12020104
• 发表时间: 2020-02-01
• 期刊: TOXINS
• 影响因子: 4.2
• 作者: Li, Xiaoyi;Miyamoto, Kazuhisa;Watanabe, Kenji
• 通讯作者: Watanabe, Kenji