水溶液中における蛍光タンパク質発色団部位の選択的赤外分光計測

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本研究では、過渡蛍光検出赤外(TFD-IR)分光法と顕微鏡技術を組み合わせた共鳴IR法により、蛍光タンパク質発色団部位の選択的な赤外分光計測法を確立し、 発色団部位の局所的な構造解析を行うことを目的としている。共鳴IR法を蛍光タンパク質に適用すると、可視光を用いた場合はタンパク質部位はエネルギー的に励起一重項状態に励起できないため蛍光は発生しないが、発色団部位からのみ過渡蛍光が発生する。この強度をモニターしながら、赤外光を波長掃引することで、発色団部位のみの赤外スペクトルを得られる。 本手法を用い、類似発色団を持ちながら、吸収・発光特性の異なる4つの蛍光タンパク質に対して赤外スペクトル測定を行ったところ、全ての蛍光タンパク質において発色団部位のみの赤外スペクトルを選択的に得ることに成功した。これらのスペクトルは非常に高いS/N比で発色団部位のみの赤外スペクトルを選択的に得られており、スペクトルを比較すると、ピークの現れる位置や相対強度などの構造が異なることも見出している。この違いは発色団の構造の違いを反映しており、発色団の構造が非常に近いphiYFPやmOrange、eYFPなどでは、ピークの現れる位置が殆ど同一であることがわかった。 また、ラマンスペクトルが測定されている蛍光タンパク質については、共鳴IRスペクトルにおいていくつかのバンドがラマンスペクトルに比べて増強されることも分かった。この強度パターンにはFranck-Condon因子が寄与しており、励起状態における構造変化の有無に関する議論も可能であると期待する。加えて、TFD-IR法の特徴である、振動緩和過程の観測が可能である点を利用して、いくつかのピークについては、その時間変化がどのようになるのかも観察している。今後は発色団の分子構造、電子状態の解明を目指し、測定・解析を行っていく。