酵素変異体-蛍光基質による2価マンガンのシグナル増強型検出法

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本研究課題では生体内で必須元素であるマンガンの挙動解析技術を確立し、本元素の未知の生体内機能を解明することを目指す。その解析技術として、マンガンに結合して活性化する酵素変異体と本酵素特異的な蛍光性基質を合成し、本酵素-基質ペアによるシグナル増強型の検出方法を開発する。本酵素変異体はマンガンとニッケルを補因子としており、マンガンはμＭオーダーで酵素に結合して活性化するのに対して、ニッケルはｍＭオーダーの高濃度を必要とするため、実質的に生体内ではマンガン選択的な酵素活性のスイッチングを実現可能と推測した。また本合成基質は立体的嵩高さによって内因性酵素による非特異的な応答を抑える工夫を行った。本年度では研究代表者の異動に伴って、タンパク質発現系および評価系での実験環境の調整に務めた。その間に本酵素の設計を見直し、マンガン配位サイトに類似したHisタグ部位によるマンガン検出能への影響について着目し、Hisタグを有さない酵素変異体を新たに調製している。今後は本タンパク質の評価により、Hisタグ部位によるマンガン駆動での酵素活性への影響を確認していく。また同時に設計済みの酵素について発現と精製を行い、これら酵素における金属間での選択性(酵素活性)を評価し、予想どおりにマンガン選択的な酵素活性のスイッチングを確認できた。また基質分子の合成も完了しており、今後は酵素-基質ペアでのマンガン検出を評価しながら基質分子の構造最適化を行ったのちに細胞系でのマンガン検出を実現していく。