Characterizing the roles of oocyte-specific factors in inhibiting unique features of the sperm epigenome

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雌雄の配偶子は異なるゲノム機能をもち、接合により相互補完されることにより発生能（全能性）を獲得する。本研究では、ゲノム機能制御の代表例である配偶子のエピゲノム（特にDNAメチル化）制御に着目する。具体的には、①卵母細胞エピゲノムの雄性化を抑制する卵母細胞因子の同定と②その因子の発現制御機構の解明を目指す。初年度は、①の達成を目指し、以下の2項目を実施した。（1）卵母細胞因子を欠損するマウスES細胞の作出とそのES細胞を起点とした卵母細胞の誘導（後述の卵巣の体外再構築系を利用）と（2）因子欠損型の卵母細胞における全ゲノムDNAメチル化地図の作成である。（1）CRISPR/Cas9法により、卵母細胞因子の発現制御領域を欠損させたES細胞を作出した。このES細胞を起点として、エピブラスト様細胞を誘導したのちに、始原生殖細胞様の細胞へと分化させた。セルソーターにより分取した始原生殖細胞様の細胞を胎齢12.5日胚の卵巣体細胞と凝集させたのちに、気相液相培養を行い、体外で卵巣を構築した。この体外再構築卵巣から二次卵母細胞を採取し、定量PCR法により卵母細胞因子の発現消失を確認した。（2）酵素反応をベースとするDNAメチル化解析手法のEM-seq（Enzymatic Methyl-seq）法を微量細胞へと最適化したのちに全ゲノムDNAメチル化解析に着手した。野生型、因子欠損型の二次卵母細胞からEM-seq法によりライブラリーを調製し、全ゲノムDNAメチル化地図を作成した。現在、欠損型においてDNAメチル化変化領域の抽出を進めている。最後に、本研究で取り上げている生殖細胞の発生とエピゲノム動態の現状のまとめと展望についての総説を発表した（Shirane, 2022）。