Characterizing the roles of oocyte-specific factors in inhibiting unique features of the sperm epigenome

描述卵母细胞特异性因子在抑制精子表观基因组独特特征中的作用

• 批准号: 22K15125
• 负责人: 白根 健次郎
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15125/
• 关键词: 卵母細胞; 発生能獲得; エピゲノム; 転写因子ネットワーク; 体外再構築系

雌雄の配偶子は異なるゲノム機能をもち、接合により相互補完されることにより発生能（全能性）を獲得する。本研究では、ゲノム機能制御の代表例である配偶子のエピゲノム（特にDNAメチル化）制御に着目する。具体的には、①卵母細胞エピゲノムの雄性化を抑制する卵母細胞因子の同定と②その因子の発現制御機構の解明を目指す。初年度は、①の達成を目指し、以下の2項目を実施した。（1）卵母細胞因子を欠損するマウスES細胞の作出とそのES細胞を起点とした卵母細胞の誘導（後述の卵巣の体外再構築系を利用）と（2）因子欠損型の卵母細胞における全ゲノムDNAメチル化地図の作成である。（1）CRISPR/Cas9法により、卵母細胞因子の発現制御領域を欠損させたES細胞を作出した。このES細胞を起点として、エピブラスト様細胞を誘導したのちに、始原生殖細胞様の細胞へと分化させた。セルソーターにより分取した始原生殖細胞様の細胞を胎齢12.5日胚の卵巣体細胞と凝集させたのちに、気相液相培養を行い、体外で卵巣を構築した。この体外再構築卵巣から二次卵母細胞を採取し、定量PCR法により卵母細胞因子の発現消失を確認した。（2）酵素反応をベースとするDNAメチル化解析手法のEM-seq（Enzymatic Methyl-seq）法を微量細胞へと最適化したのちに全ゲノムDNAメチル化解析に着手した。野生型、因子欠損型の二次卵母細胞からEM-seq法によりライブラリーを調製し、全ゲノムDNAメチル化地図を作成した。現在、欠損型においてDNAメチル化変化領域の抽出を進めている。最後に、本研究で取り上げている生殖細胞の発生とエピゲノム動態の現状のまとめと展望についての総説を発表した（Shirane, 2022）。

Male and female mating pairs are different in function, complementary in function, and versatile in function. This study is a representative example of the functional control of DNA. Specific aspects include: (1) the regulation of oocyte factors and the regulation of oocyte factors, and (2) the elucidation of the mechanisms for the regulation of oocyte factors. In the beginning of the year, the following two projects were implemented. (1) Oocyte Factor Deficiency and ES Cell Production Start and Oocyte Induction (Use of in Vitro Reconstruction System of Oocyte as described later);(2) Factor Deficiency and Oocyte Production Complete DNA Transformation. (1) CRISPR/Cas9 method is used to control the expression of oocyte factors in ES cells. The origin of ES cells, the origin of germ cells. In vitro culture of embryonic germ cells and somatic cells in vitro This in vitro reconstruction of oocytes and secondary oocytes was confirmed by quantitative PCR. (2) EM-seq (Enzymatic Methyl-seq) method is used to optimize microcellular DNA analysis. Wild type, factor-deficient type secondary oocytes were prepared by EM-seq method. Now, in the absence of damage, DNA is extracted from the field of transformation. Finally, this research will provide a comprehensive overview of the current status and prospects of germ cell development and the dynamics of germ cells (Shirane, 2022).