脳梗塞後遺症治療に向けた神経傷害性アストロサイトを誘導する転写調節機構の解明

阐明诱导神经毒性星形胶质细胞治疗脑梗塞后遗症的转录调控机制

• 批准号: 22K15285
• 负责人: 喜多 絢海
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Setsunan University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15285/
• 关键词: タンパク質間相互作用; 反応性アストロサイト; 脳梗塞

梗塞脳で出現する反応性アストロサイトには、神経傷害的なA1、神経保護的なA2が存在し、A1アストロサイトは脳梗塞後の神経再生過程における有害因子である。本研究では、A1およびA2アストロサイト両者の出現を促進するSTAT3に着目し、A1およびA2アストロサイトの出現過程におけるSTAT3のタンパク質間相互作用を解析することでA1アストロサイトの出現に特異的な相互作用を同定する。また、同定した相互作用の制御によるA1アストロサイトの出現の抑制が脳梗塞後の脳機能回復にもたらす影響を解析することで、新たな脳梗塞後遺症の治療標的の発見を目指す。令和４年度では、細胞内光クロスリンク法を用いて、ラットアストロサイトがA1およびA2アストロサイトへと変化する過程でのSTAT3のタンパク質間相互作用の変化を調べることにした。A1およびA2アストロサイトへは既報の手法を用いて、ラットアストロサイトからの誘導を試みた。各マーカー分子の発現量を確認したところ、A1アストロサイトへの誘導は良好に行えていたが、A2アストロサイトを誘導することは出来なかった。そこで、A1アストロサイトについてのみ解析を進めることにした。光クロスリンカーを導入したSTAT3を発現させたラット初代培養アストロサイトを、A1アストロサイトに誘導し、経時的な相互作用の変化をWestern blottingによって解析した。光クロスリンカーはSTAT3の相互作用に重要なドメインであるN末端ドメインおよびC末端ドメインのタンパク質表面に導入した。誘導開始から0.5～2時間後にSTAT3の相互作用に変化が見られた。そこで、次に、変化している相互作用を同定するべく、質量分析を行うことにしたが、解析に必要なタンパク質量が十分に得られなかった。現在、質量分析で解析可能なタンパク質複合体量を得るために条件の検討を行っている。

梗塞大脑中出现的反应性星形胶质细胞包括神经损伤A1和神经保护A2，A1星形胶质细胞是脑梗塞后神经再生过程中的有害因素。在这项研究中，我们专注于STAT3，该研究促进了A1和A2星形胶质细胞的外观，并通过分析A1和A2星形胶质细胞的出现过程中STAT3的蛋白质 - 蛋白质相互作用来识别针对A1星形胶质细胞外观的相互作用。此外，通过分析抑制A1星形胶质细胞外观的影响，通过控制大脑梗死后识别的相互作用对脑功能的恢复，我们旨在发现脑梗塞后治疗后遗症的新目标。在2022年，我们决定使用细胞内的光叠链链接来研究大鼠星形胶质细胞转化为A1和A2星形胶质细胞过程中Stat3蛋白质蛋白质相互作用的变化。使用先前报道的方法，使用A1和A2星形胶质细胞从大鼠星形胶质细胞中诱导它们。当确认每个标记分子的表达水平时，对A1星形胶质细胞的诱导是成功的，但是不可能诱导A2星形胶质细胞。因此，我们决定仅对A1星形胶质细胞进行分析。诱导了带有光叠链链链球链球链球链球链球链球链球链球菌的原代培养的大鼠星形胶质细胞，诱导了A1星形胶质细胞，随着时间的推移，相互作用的变化通过蛋白质印迹分析。将光叠链链接引入了N末端和C末端结构域的蛋白质表面，这对于STAT3相互作用很重要。诱导后0.5至2小时观察到STAT3相互作用的变化。因此，我们接下来决定执行质谱法以识别发生变化的相互作用，但是分析所需的蛋白质量还不够。目前，正在研究条件以获得可以通过质谱法分析的蛋白质复合物的量。