OMVに着目した脳バリア破綻とアルツハイマー病におけるジンジパイン仮説の検証

申請者は、これまでに、アルツハイマー病の発症・増悪を招くとされる代表的な歯周病菌のジンジバリス菌が分泌するプロテアーゼのジンジパインが、密着結合構成タンパク質のZO-1やオクルディンを直接分解することで、脳血管内皮細胞の透過性を上げ、菌自体や病原性因子の脳実質への侵入を可能にすることを発見した。しかし、これらジンジパインの標的タンパク質のアミノ酸配列を調べたところ、ジンジパインによる切断可能配列が、細胞外に出ていないことが分かった。このことは、ジンジパインが細胞内に入ってこれらタンパク質を切断することを示唆するが、その仕組みはわかっていなかった。2022年度はその解明に取り組み、以下のような実験により、ジンジバリス菌が分泌するouter membrane vesicle(OMV）を運び屋としてジンジパインが細胞内に侵入し、ZO-1やオクルディンといった密着結合構成タンパク質を細胞の内側から分解することを明らかにした。1. ジンジパインの結合したOMVのヒト脳血管内皮細胞株への侵入：ジンジバリス菌の培養上清からエキソソーム抽出キットを用いて調製したOMVを蛍光色素のCy5でラベルした後、ヒト脳血管内皮細胞株(hCMEC/D3細胞)に添加し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。その結果、Cy5のシグナルが細胞内から検出された。また、同じ細胞に対して、抗ジンジパイン抗体を用いた免疫染色を行ったところ、そのシグナルが細胞内のCy5シグナルと重なっていた。以上のことから、ジンジパインはOMVに結合した状態で脳血管内皮細胞に侵入すると考えられた。2. ジンジバリス菌OMVによる密着結合タンパク質の分解：OMVのみを添加しても、hCMEC/D3細胞におけるZO-1及びオクルディンレベルの減少が見られることがウエスタンブロッティングで確認された。

申請者は、これまでに、アルツハイマー病の発症・増悪を招くとされる代表的な歯周病菌のジンジバリス菌が分泌するプロテアーゼのジンジパインが、密着結合構成タンパク質のZO-1やオクルディンを直接分解することで、脳血管内皮細胞の透過性を上げ、菌自体や病原性因子の脳実質への侵入を可能にすることを発見した。しかし、これらジンジパインの標的タンパク質のアミノ酸配列を調べたところ、ジンジパインによる切断可能配列が、細胞外に出ていないことが分かった。このことは、ジンジパインが細胞内に入ってこれらタンパク質を切断することを示唆するが、その仕組みはわかっていなかった。2022年度はその解明に取り組み、以下のような実験により、ジンジバリス菌が分泌するouter membrane vesicle(OMV）を運び屋としてジンジパインが細胞内に侵入し、ZO-1やオクルディンといった密着結合構成タンパク質を細胞の内側から分解することを明らかにした。1. ジンジパインの結合したOMVのヒト脳血管内皮細胞株への侵入：ジンジバリス菌の培養上清からエキソソーム抽出キットを用いて調製したOMVを蛍光色素のCy5でラベルした後、ヒト脳血管内皮細胞株(hCMEC/D3細胞)に添加し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。その結果、Cy5のシグナルが細胞内から検出された。また、同じ細胞に対して、抗ジンジパイン抗体を用いた免疫染色を行ったところ、そのシグナルが細胞内のCy5シグナルと重なっていた。以上のことから、ジンジパインはOMVに結合した状態で脳血管内皮細胞に侵入すると考えられた。2. ジンジバリス菌OMVによる密着結合タンパク質の分解：OMVのみを添加しても、hCMEC/D3細胞におけるZO-1及びオクルディンレベルの減少が見られることがウエスタンブロッティングで確認された。