Development of rapid screening method to discover peptides capable of binding to target proteins using split intein

开发快速筛选方法以发现能够利用分裂内含肽结合靶蛋白的肽

• 批准号: 22K05344
• 负责人: 高橋 剛
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Gunma University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05344/
• 关键词: インテイン; 標的結合ペプチド; ペプチドライブラリ; スクリーニング

分割インテインは、2つのポリペプチド鎖をprotein trans-splicing (PTS) 反応で連結させる酵素様のタンパク質である。申請者は、分割インテインを用いた、リガンド－タンパク質間相互作用検出系の開発を進めている。改変型分割インテインに、相互作用を調べたいペプチドとタンパク質を融合することで、ペプチド－タンパク質間の相互作用に依存してPTS反応が進行する系を構築した。反応の生成物として、カナマイシン耐性遺伝子産物であるaminoglycoside-3’-phosphotransferase IIIa（APH(3’)-IIIa; 以下APH）を用いることで、ペプチド－タンパク質間の相互作用を大腸菌の生存を指標として検出できる。R4年度は、この方法を用いて、がん関連タンパク質であるMDM2に結合するペプチドの探索を実施した。ペプチドライブラリをコードする遺伝子ライブラリを作製し、MDM2との結合スクリーニングを行った。ライブラリ中のMDM2結合ペプチドとMDM2が相互作用することで、活性型APHが生成し、カナマイシン含有培地中でも大腸菌が生存できると期待した。形質転換した大腸菌をカナマイシン含有寒天培地で培養し、得られたコロニーからペプチド配列を解析した。その結果、MDM2に強く結合するペプチドを複数種類獲得することに成功した。また、得られたペプチドを化学合成し、MDM2との解離定数を算出した。R5年度は、得られたペプチドが実際に細胞内でMDM2に結合し、細胞のアポトーシスを誘導するか、検討する予定である。

Segmentation イ ン テ イ ン は, 2 つ の ポ リ ペ プ チ ド lock を protein trans - splicing (PTS) against 応 で link さ せ る enzyme others の タ ン パ ク qualitative で あ る. Applicants は, segmentation イ ン テ イ ン を with い た, リ ガ ン ド - タ ン パ ク qualitative interaction between 検 out started の 発 を into め て い る. Change - type split イ ン テ イ ン に, interaction を べ た い ペ プ チ ド と タ ン パ ク qualitative を fusion す る こ と で, ペ プ チ ド - タ ン パ の interaction between ク qualitative に dependent し て PTS anti 応 が for す る department を build し た. Anti応 <s:1> products と て て, カナ カナ シ シ 伝 伝 dependent products であるaminoglycoside-3 '-phosphotransferase IIIa (APH(3')-IIIa); "を APH) with い る こ と で, ペ プ チ ド - タ ン パ の interaction between ク qualitative を coliform の survival を index と し て 検 out で き る. R4 annual は, こ の way を with い て, が ん masato even タ ン パ ク qualitative で あ る MDM2 に combining す る ペ プ チ ド の explore を be applied し た. ペ プ チ ド ラ イ ブ ラ リ を コ ー ド す る posthumous son 伝 ラ イ ブ ラ リ を as し, MDM2 と の combining ス ク リ ー ニ ン グ を line っ た. In ラ イ ブ ラ リ の MDM2 combining ペ プ チ ド と MDM2 が interaction す る こ と で type, active APH が generated し, カ ナ マ イ シ ン contained in the petty で も coliform が survival で き る と expect し た. Form quality planning in し た coliform を カ ナ マ イ シ ン contains sees the petty で し, too ら れ た コ ロ ニ ー か ら ペ プ チ ド match column を parsing し た. The そ そ result, MDM2に strongly く combined with するペプチドを plural types obtained する とに とに とに successfully た た. Youdaoplaceholder0, obtain られたペプチドを, chemically synthesize, MDM2と, the <s:1> dissociation number を, calculate た. Annual は R5, and ら れ た ペ プ チ ド が be interstate に intracellular で MDM2 に し, cell の ア ポ ト ー シ ス を induced す る か, beg す 検 る designated で あ る.

项目成果

分割インテインとカナマイシンキナーゼの再構成を利用した新規リガンド探索法の構築

利用分裂内含肽构建新的配体发现方法并重建卡那霉素激酶

• 发表时间: 2023
• 作者: 信澤 佳奈;渡辺 雄太郎;高橋 剛
• 通讯作者: 高橋 剛

Luminescence detection of peptide:<i>N</i>-glycanase activity using engineered split inteins

使用工程化的分裂内含肽发光检测肽：<i>N</i>-聚糖酶活性

• DOI: 10.1039/d2cc04865e
• 发表时间: 2022
• 期刊: Chemical Communications
• 影响因子: 4.9
• 作者: Takahashi Tsuyoshi;Uchibayashi Tatsuya;Ishii Nozomi;Matsuo Ichiro;Yoshida Yukiko;Suzuki Tadashi
• 通讯作者: Suzuki Tadashi

Selection of peptides capable of binding to MDM2 using an engineered split intein

使用工程化的分裂内含肽选择能够结合 MDM2 的肽

• 发表时间: 2022
• 作者: 渡辺雄太郎;高橋剛
• 通讯作者: 高橋剛

Construction of a detection method for peptide: N-glycanase activity using engineered split inteins

利用工程化的分裂内含肽构建肽：N-聚糖酶活性检测方法

• 发表时间: 2022
• 作者: 内林達也;高橋諭;石井希実;松尾一郎;吉田雪子;鈴木匡;高橋剛
• 通讯作者: 高橋剛

糖ペプチドの合成と細胞質ペプチド:N-グリカナーゼおよびエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼによる反応性の検討

糖肽和细胞质肽的合成：检查与 N-聚糖酶和内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的反应性

• 发表时间: 2023
• 作者: 井上遥;高橋諭;石井希実;松尾一郎;吉田雪子;鈴木匡;高橋剛
• 通讯作者: 高橋剛