Development of rapid screening method to discover peptides capable of binding to target proteins using split intein

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分割インテインは、2つのポリペプチド鎖をprotein trans-splicing (PTS) 反応で連結させる酵素様のタンパク質である。申請者は、分割インテインを用いた、リガンド－タンパク質間相互作用検出系の開発を進めている。改変型分割インテインに、相互作用を調べたいペプチドとタンパク質を融合することで、ペプチド－タンパク質間の相互作用に依存してPTS反応が進行する系を構築した。反応の生成物として、カナマイシン耐性遺伝子産物であるaminoglycoside-3’-phosphotransferase IIIa（APH(3’)-IIIa; 以下APH）を用いることで、ペプチド－タンパク質間の相互作用を大腸菌の生存を指標として検出できる。R4年度は、この方法を用いて、がん関連タンパク質であるMDM2に結合するペプチドの探索を実施した。ペプチドライブラリをコードする遺伝子ライブラリを作製し、MDM2との結合スクリーニングを行った。ライブラリ中のMDM2結合ペプチドとMDM2が相互作用することで、活性型APHが生成し、カナマイシン含有培地中でも大腸菌が生存できると期待した。形質転換した大腸菌をカナマイシン含有寒天培地で培養し、得られたコロニーからペプチド配列を解析した。その結果、MDM2に強く結合するペプチドを複数種類獲得することに成功した。また、得られたペプチドを化学合成し、MDM2との解離定数を算出した。R5年度は、得られたペプチドが実際に細胞内でMDM2に結合し、細胞のアポトーシスを誘導するか、検討する予定である。