アミノ酸輸送体LAT1依存的リン酸化シグナルにおけるチロシンリン酸化制御機構解明

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がん細胞では，細胞増殖等の調節に関わるタンパク質の翻訳後修飾リン酸化ネットワークの制御に異常が生じている．アミノ酸はこのリン酸化ネットワークを刺激するシグナル分子としての機能を持つ．がん細胞特異的アミノ酸トランスポーターLAT1は，がん特異的な細胞内環境形成に寄与するアミノ酸シグナル機構を構成しているものと考えられる．申請者はこれまで，固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー (IMAC) によるリン酸化濃縮法を用いたプロテオーム解析により，LAT1を起点としたリン酸化ネットワークを解明してきた．この方法は主にセリン・スレオニンのリン酸化動態の広範な解明には非常に有用である一方で，悪性腫瘍の発生に深く関与する受容体型・非受容体型チロシンキナーゼが触媒するチロシンのリン酸化は微量なため同定が難しく，より特異的な方法が必要であった．本年度では，まず (1) 非常に特異性の高い競合的LAT1阻害薬ナンブランラト (JPH203) により有意な抗腫瘍効果を評価済みの胆道がん細胞株3種類(KKU-055, KKU-100, KKU-213) において，タンパク質チロシンリン酸化ネットワーク変動に加えて、グローバルリン酸化ネットワーク変動および発現タンパク質変動を詳細に調べた．具体的には，LAT1阻害薬の添加の有無のそれぞれの条件で24 時間処理した細胞サンプルから，相間移動溶解剤による抽出法でタンパク質を抽出し，サンプル調製を行い，定量チロシンリン酸化・定量リン酸化プロテオーム解析による修飾動態差異解析，定量プロテオーム解析による発現差異解析に供した．これらの結果を統計学的抽出およびデータベース化し，統計学的に有意な発現変動分子群,およびリン酸化修飾変動分子群を分子ネットワーク解析ソフトIPAによって解析した．