トロンボモジュリン結合障害型異常プロトロンビンによる血栓形成機構の分子学的解析

点击翻译按钮获取中文摘要

今年度は、野生型（WT）および、アンチトロンビンとの結合親和性低下（ATR）およびトロンボモジュリンとの結合親和性低下（TMR）を示すと予測された変異型プロトロンビン（M380T、R431H、R596L）を作製した。プロトロンビンはNi-NTAを用いたHisタグ精製およびGla化プロトロンビンのみを精製するためバリウム吸着を行ない、CBB染色にて高純度のリコンビナントプロトロンビンを精製できていることを確認した。凝固時間法による活性測定では、WTは血漿由来ヒトプロトロンビンと同等の活性を有し、WTを100%とするとM380Tは9.0%、R431Hは37.7%、R596Lは44.5%であり、全ての変異体において出血傾向の性質を示した（p<0.0001）。トロンビン特異的な蛍光基質を用いたアミド分解活性測定法を確立し、WTを100%としたところ、M380Tは63.9%（p<0.0001）と有意に低下したが、R431Hは88.9%、R596Lは107.5%とWTと同等であった。ここまでの結果より、M380Tは出血傾向を呈することから、ATR・TMRの解析からは除外した。ウエスタンブロットで検出したトロンビンーAT複合体（TAT）形成量は、WTを100 %としたところR431Hは100 %であったが、R596Lは7.5 % しか形成されなかった（p<0.01）。さらに、合成基質法の測定系を用いて、AT存在下での残存トロンビン活性を測定した。WTおよびR431Hでは反応時間の経過に伴い残存トロンビン活性が低下した。一方で、R596Lでは残存トロンビン活性がほとんど低下せず、WTに比べ有意に高い残存トロンビン活性を維持していた。以上より、R431HはATRはほとんど有していないと考えられた。