トロンボモジュリン結合障害型異常プロトロンビンによる血栓形成機構の分子学的解析

异常凝血酶原与血栓调节蛋白结合受损导致血栓形成机制的分子分析

• 批准号: 22K15663
• 负责人: 長屋 聡美
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Kanazawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15663/
• 关键词: 異常プロトロンビン; アンチトロンビン抵抗性; トロンボモジュリン抵抗性; プロトロンビン; トロンボモジュリン結合障害; 血栓症

今年度は、野生型（WT）および、アンチトロンビンとの結合親和性低下（ATR）およびトロンボモジュリンとの結合親和性低下（TMR）を示すと予測された変異型プロトロンビン（M380T、R431H、R596L）を作製した。プロトロンビンはNi-NTAを用いたHisタグ精製およびGla化プロトロンビンのみを精製するためバリウム吸着を行ない、CBB染色にて高純度のリコンビナントプロトロンビンを精製できていることを確認した。凝固時間法による活性測定では、WTは血漿由来ヒトプロトロンビンと同等の活性を有し、WTを100%とするとM380Tは9.0%、R431Hは37.7%、R596Lは44.5%であり、全ての変異体において出血傾向の性質を示した（p<0.0001）。トロンビン特異的な蛍光基質を用いたアミド分解活性測定法を確立し、WTを100%としたところ、M380Tは63.9%（p<0.0001）と有意に低下したが、R431Hは88.9%、R596Lは107.5%とWTと同等であった。ここまでの結果より、M380Tは出血傾向を呈することから、ATR・TMRの解析からは除外した。ウエスタンブロットで検出したトロンビンーAT複合体（TAT）形成量は、WTを100 %としたところR431Hは100 %であったが、R596Lは7.5 % しか形成されなかった（p<0.01）。さらに、合成基質法の測定系を用いて、AT存在下での残存トロンビン活性を測定した。WTおよびR431Hでは反応時間の経過に伴い残存トロンビン活性が低下した。一方で、R596Lでは残存トロンビン活性がほとんど低下せず、WTに比べ有意に高い残存トロンビン活性を維持していた。以上より、R431HはATRはほとんど有していないと考えられた。

This year, wild-type (WT), mutant and low binding affinity (ATR), mutant and low binding affinity (TMR) were predicted to be controlled by mutant (M380T, R431H, R596L). Ni-NTA is used to purify and purify His products. It is confirmed that CBB dyeing is used to purify and purify his products. Coagulation time assay showed that WT had the same activity as M380T, WT 100%, R431H 37.7%, R596L 44.5%, WT 100%, WT 100%. The activity assay for the specific photo-matrix was established, WT = 100% and M380T = 63.9%(p<0.0001), R431H = 88.9% and R596L = 107.5% The result of this analysis is that the M380T has a bleeding tendency except for ATR and TMR. R431H and R596L were 100% and 7.5% respectively (p<0.01). In addition, the synthetic matrix method was used to determine the residual activity in the presence of AT. WT R431H has a low activity in response to the passage of time. On the one hand, R596L has a low residual activity, while WT has a high residual activity. The R431H has a high resistance to ATR.

项目成果

The potential of PS cleavage to regulate anticoagulant function in septic DIC

PS 裂解调节脓毒症 DIC 抗凝功能的潜力

• 发表时间: 2022
• 作者: Satomi Nagaya;Koichi Yamaguchi;Asaka Matsui;Tomohide Tsuda;Eriko Morishita
• 通讯作者: Eriko Morishita

A case of venous thromboembolism caused by protein C deficiency due to a novel gene mutation

新型基因突变导致蛋白C缺乏导致静脉血栓栓塞1例

• DOI: 10.1016/j.jccase.2022.07.012
• 发表时间: 2022
• 期刊: Journal of Cardiology Cases
• 作者: Noiri Jun-ichi;Matsuzoe Hiroki;Nagaya Satomi;Nishio Ryo;Matsumoto Daisuke;Takaishi Hiroshi;Morishita Eriko
• 通讯作者: Morishita Eriko

Molecular characterization of a novel splicing mutation of the PROS1 gene causing inherited protein S deficiency

导致遗传性蛋白 S 缺陷的 PROS1 基因新型剪接突变的分子特征

• 发表时间: 2022
• 作者: Tomoki Togashi;Satomi Nagaya;Makiko Meguro-Horike;Yuta Imai;Yuka Makita;Kensho Omori;Shin-Ichi Horike;Eriko Morishita
• 通讯作者: Eriko Morishita

Identification and functional analysis of three novel genetic variants resulting in premature termination codons in three unrelated patients with hereditary antithrombin deficiency

导致三名无关的遗传性抗凝血酶缺乏症患者过早终止密码子的三种新遗传变异的鉴定和功能分析

• DOI: 10.1007/s12185-022-03509-3
• 发表时间: 2022
• 期刊: International Journal of Hematology
• 影响因子: 2.1
• 作者: Imai Yuta;Nagaya Satomi;Araiso Yuhei;Meguro-Horike Makiko;Togashi Tomoki;Ohmori Kensho;Makita Yuka;Sato Eiichi;Yujiri Toshiaki;Nagamori Yuta;Horike Shin-ichi;Watanabe Atsushi;Morishita Eriko
• 通讯作者: Morishita Eriko

Effects of sample processing on antithrombin and protein C activity

样品处理对抗凝血酶和蛋白 C 活性的影响

• 发表时间: 2022
• 作者: Satomi Nagaya;Koichi Yamaguchi;Eriko Morishita
• 通讯作者: Eriko Morishita