立体構造をもとにした酵母由来の転写因子Pho4による分子認識機構の解明

基于三维结构阐明酵母源转录因子Pho4的分子识别机制

• 批准号: 09780609
• 负责人: 清水 敏之
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09780609/
• 关键词: Pho4; 立体構造; bHLH; 転写因子; 分子認識; 蛋白質.核酸複合体; 蛋白質核酸複合体

出芽酵母のPHO4は細胞内のリン酸濃度の調節系遺伝子群を制御している正の転写調節因子である。本研究は、この蛋白質の分子認識機構を目的としているが、最初のステップとして63残基からなるPHO4のDNA結合ドメイン(PHO4(63))とその認識配列(UASp2:17塩基)との複合体を結晶化し、PHO4によるDNA認識機構を2.8Å分解能でX線結晶解析により解明している。さらに親和性の違う認識配列(UASpl,UASp3)との複合体との結晶化にも成功しているが原子レベルでの議論が可能な結晶はまだ得られていない。一方DNA結合ドメインをさらにN末側に長くしたPHO4(85)と認識配列との結晶化にも成功しており分解能3Å分解能のデータを得、現在解析を進めており、N末側の部分がそのままへリックス構造をとっていることが判明しつつある。一方全長のPHO4は培養条件並びに精製条件を検討しているが、PHO4単独ではミセル状態を形成しており結晶化には不利な状態となっていることがわかった。界面活性剤を添加することによりある程度解消されるがそれでもまだ多分散系となっている。そこでPHO4と結合する因子と結合させることによってこの多分散系を解消することにした。PHO4と相互作用するPHO2の精製を試みているが発現量が少なく培養条件等を探索している。現在のところは蛋白質単独並びに蛋白質-DNA複合体の系で結晶化条件を試している。全長の真核生物の転写因子が結晶可能な量とれる系はほとんど報告されたことがなく今後の展開に期待がもたれる。

The regulation of intracellular acid concentration in budding yeast PHO4 is controlled by the regulation of intracellular acid concentration. In this study, the molecular recognition mechanism of this protein was studied by crystallization and X-ray crystallographic analysis of PHO4 DNA binding protein (PHO4 (63)) and its recognition alignment (UASp2:17). In addition, the affinity and dissimilarity of recognition alignment (UASpl, UASp3) and the crystallization of the complex are discussed in detail. One side DNA binding to the end of the N side of the long PHO4(85) and recognition of the alignment of the crystallization of the success of the decomposition of energy 3 decomposition of energy to obtain, now resolved to advance the N end of the part of the structure of the identification of the middle. The total length of PHO4 is cultured and purified. The PHO4 is isolated and crystallized. Interfacial active agents are added to the system to a certain extent. The combination factor of PHO4 and the polydisperse system can be used to solve the problem. The purification of PHO2 by PHO4 interaction, the amount of PHO2 produced, and the culture conditions were explored. Now, the crystallization conditions of protein-DNA complexes and protein-DNA complexes are studied. A full-length eukaryote is expected to develop in the future.

项目成果

A.Toumoto et al.: "Preliminary X-ray studies on a new crystal form of PHO4-DNA complex" Acta Crytallogr.D53. 103-104 (1997)

A.Toumoto 等人：“PHO4-DNA 复合物新晶型的初步 X 射线研究”Acta Crytallogr.D53。

T Shimizu et al.: "Crystal structure of PHO4 bHLH domain-DNA complex : Flanking base recognition" EMBO J.16. 4689-4697 (1997)

T Shimizu 等人：“PHO4 bHLH 结构域-DNA 复合物的晶体结构：侧翼碱基识别”EMBO J.16。

S.Kuge et al.: "Use of a fusion protein to obtain well-ordered crystal scitable for X-ray Analysis : crystallization of a GST fusion protein containing the DNA binding domain of DREF" Protein Sci. 6. 1783-1786 (1997)

S.Kuge 等人：“使用融合蛋白获得可用于 X 射线分析的有序晶体：含有 DREF DNA 结合域的 GST 融合蛋白的结晶”Protein Sci。

A.Ueno et al.: "Crystal structures of Sulochrin Derivatives" Chem.Pharm.Bull.46. 1929-1931 (1998)

A.Ueno 等人：“Sulochrin 衍生物的晶体结构”Chem.Pharm.Bull.46。

M.Kato et al.: "Insights into multi-step phoshorelay from the crystal structure of the C-terminal HPt domain of ArcB" Cell. 88. 717-723 (1997)

M.Kato 等人：“从 ArcB C 端 HPt 结构域的晶体结构洞察多步磷光布局”Cell。