脳内における遺伝子の部位特異的な発現制御機構に関する検討

脑内基因位点特异性表达调控机制研究

• 批准号: 09780709
• 负责人: 小林 正明
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Toho University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09780709/
• 关键词: カルシウム結合蛋白質; EF-ハンド; 脳; 海馬; 転写・発現; トランスジェニック・マウス

申請者らは神経系に特異的に発現するEFハンド型カルシウム結合蛋白質の一群を見い出し、神経特異カルシウム結合蛋白質ファミリーと命名し解析を進めている.これらの分子はいずれも脳内分布に強い偏在性をもち、なかでもヒポカルシンは記憶形成と深く関わっているといわれる大脳の海馬錐体細胞に特徴的に存在している.本研究課題では、ヒポカルシン遺伝子上の発現制御領域を解析し、脳内での発現を海馬神経細胞に限定可能なトランスジーン・ベクターの開発を目的とした.平成9年度には、in vitro転写系を用いてヒポカルシン遺伝子の発現制御領域について詳細に検討した.ラット脳より核内蛋白質を調整し、様々な欠損・変異を導入したヒポカルシン遺伝子をテンプレートとしてin vitro転写を行い、転写産物の絶対量をcompetitiveRT-PCRにより定量した.ヒポカルシン遺伝子の5'上流2000bp以上の領域にサイレンサーの存在が認められ、上流300〜500bpにはエンハンサーの存在が認められた.また、第1イントロンの下流域中にはストロング・エンハンサーの存在が認められた.平成10年度には、ヒポカルシン遺伝子の第1エキソンにLacZを導入したトランスジーン・ベクターを構築し、トランスジェニック・マウスの作成を行った.ゲノミック・サザンブロットによりトランスジーンが確認された5系統についてβ-galactosidaseの発現を検討したところ、いずれも海馬特異的で、特に歯状回顆粒細胞に特徴的な発現が認められた.ヒポカルシンの発現はCA1錐体細胞に特徴的であることから、海馬内での発現領域に逆転現象が見られた.現在、脳内での発現部位におよぼすヒポカルシシ遺伝子の第1イントロンの影響について検討を行っている.

申请人发现了一组在神经系统中特异性表达的EF手钙结合蛋白，并已通过将其命名为神经植物钙结合蛋白家族来进行分析。所有这些分子在脑分布中都具有强烈的不正当性，其中低钙素的特征是大脑的河马锥体细胞中，据说这与记忆形成深远有关。在该研究主题中，目的是分析降钙素基因上的表达控制区域，并开发可以限于海真正的神经元的转基因载体。在1997年，使用体外转录系统详细表达了海峰基因。被大鼠脑调节的海峰基因被引入模板中。在体外进行转录，并通过竞争性PCR定量转录本的绝对量。在hipocalsin基因上游的2000 bp 5'上游的区域中观察到消音器的存在，并且在300-500 bp的上游观察到增强子的存在。另外，在第一嵌入子的下游观察到了强增强子。 1998年，构建了一个转基因载体，其中将LACZ引入了Hipocalsin基因的第一个外显子，并构建了转基因载体。我们研究了β-半乳糖苷酶在通过基因组南部斑点确认转基因的五个线上的表达，发现所有转基因酶在齿状回颗粒细胞中均为海马特异性，尤其是特征性的表达。由于海马细胞的表达是CA1锥体细胞的特征，因此在海马中的表达区域观察到了逆转现象。目前，我们正在研究Hypoalcisi基因对大脑表达位点的第一个内含子的影响。

项目成果

小林正明: "神経特異カルシウム結合蛋白質" 蛋白質・核酸・酵素. (印刷中). (1998)

Masaaki Kobayashi：“神经特异性钙结合蛋白”蛋白质、核酸和酶（出版中）。

Kobayashi M.: "Isolation of two human cDNAs,HLP3 and HLP4,homologous to the neuron-specific calcium-binding protein genes" DNA Sequence. 8. 1-6 (1997)

Kobayashi M.：“分离两种人类 cDNA，HLP3 和 HLP4，与神经元特异性钙结合蛋白基因同源”DNA 序列。

小林正明ら: "神経特異Ca^<2+>結合蛋白質." 蛋白質核酸酵素. 43. 164-167 (1998)

Masaaki Kobayashi 等：“神经特异性Ca 2+ 结合蛋白。”蛋白质核酸酶。43. 164-167 (1998)

Kobayashi M,et al: "Isolation of two human cDNAs.HLP3 and HLP4, homologous to the neuron-specific calcium-binding protein genes." DNA Sequence. 9. 171-176 (1998)

Kobayashi M,et al：“分离出两种人类 cDNA。HLP3 和 HLP4，与神经元特异性钙结合蛋白基因同源。”

Miwa N,et al.: "Purification and molecular cloning of a novel calcium-binding protein.p26olf, in the frog olfactory epithelium." Biochem.Biophys.Res.Commun.251. 860-867 (1998)

Miwa N 等人：“青蛙嗅觉上皮细胞中新型钙结合蛋白 p26olf 的纯化和分子克隆。”