小脳の形態形成に関わるフォスファターゼ阻害因子の研究

本年度は科研費交付申請書に記したとおり、(1)II・III型LANPのクローニングと一次構造決定、(2)プロテインフォスファターゼ阻害の活性測定系の確立、(3)サブタイプの小脳における発現時期や局在の解析(4)プロテインフォスファターゼとの結合活性の解析を行った。(1)についてはRT-PCRを中心に解析を行っていたが、計画を変更し、in silico cloning的な手法を取り入れて解析を行った。cDNAは、IMAGE consortiumより入手し、それらのcDNAがLANP II・III型のcDNAであることを制限酵素地図から確認した。LANP II・IIIはそれぞれ、272、260アミノ酸からなり、ロイシンリッチリピート構造の5回の繰り返しと酸性アミノ酸クラスター構造、核移行シグナルを持っていることを確認した。(2)については、リン酸化された基質をフォスファターゼで脱リン酸化し、その際に、発現させたLANPファミリーに属するタンパク質を反応液に加え、反応を解析した。GST-LANP IにはHong-Guoらの報告に比べ30分の1程度の活性があることを確認している。他のサブタイプについては実験が進行中である。(3)についてはプローブとなるLANP II・III型のcDNAの精製が進行中であり、結果は3月中に得られるものと思われる。(4)については、GST-LANP Iの融合タンパク質を精製し、組織抽出液と混合して、グルタチオン樹脂に結合、沈降させ、SDS-PAGE後に免疫化学的な解析を行った。抗フォスファターゼ抗体による陽性のシグナルは得られず、直接的な結合は確認できなかった。LANP II・皿についても実験が進行している。

本年度は科研費交付申請書に記したとおり、(1)II・III型LANPのクローニングと一次構造決定、(2)プロテインフォスファターゼ阻害の活性測定系の確立、(3)サブタイプの小脳における発現時期や局在の解析(4)プロテインフォスファターゼとの結合活性の解析を行った。(1)についてはRT-PCRを中心に解析を行っていたが、計画を変更し、in silico cloning的な手法を取り入れて解析を行った。cDNAは、IMAGE consortiumより入手し、それらのcDNAがLANP II・III型のcDNAであることを制限酵素地図から確認した。LANP II・IIIはそれぞれ、272、260アミノ酸からなり、ロイシンリッチリピート構造の5回の繰り返しと酸性アミノ酸クラスター構造、核移行シグナルを持っていることを確認した。(2)については、リン酸化された基質をフォスファターゼで脱リン酸化し、その際に、発現させたLANPファミリーに属するタンパク質を反応液に加え、反応を解析した。GST-LANP IにはHong-Guoらの報告に比べ30分の1程度の活性があることを確認している。他のサブタイプについては実験が進行中である。(3)についてはプローブとなるLANP II・III型のcDNAの精製が進行中であり、結果は3月中に得られるものと思われる。(4)については、GST-LANP Iの融合タンパク質を精製し、組織抽出液と混合して、グルタチオン樹脂に結合、沈降させ、SDS-PAGE後に免疫化学的な解析を行った。抗フォスファターゼ抗体による陽性のシグナルは得られず、直接的な結合は確認できなかった。LANP II・皿についても実験が進行している。