小脳形成に関わるチロシンリン酸化タンパク質群のプロテオーム解析

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チロシンリン酸化タンパク質の小脳のステージごとの変化を解析するためには、同定される各タンパク質の定量的なデータを取得した後に、それらを網羅的に比較をする必要があると考えられた。そこで、チロシンリン酸化タンパク質(ペプチド)の同位体希釈法による定量解析について、モデルタンパク質を利用して評価検討した。モデルタンパク質はリジルエンドペプチダーゼで限定的に分解し、生じたペプチドのアミノ末端とリジンのアミノ基を、同位体標識した新規試薬で修飾した。修飾効率は、アミノ末端よりもリジンアミノ基の方が高く、アミノ末端はほとんど修飾されなかった。異なった同位体によって標識されたペプチドは混合後、LC-ESI/TOFMSで分析され、タンデムMS法によって同定された。同定されたペプチドの定量は、スペクトルから得られるそれぞれの同位体MSシグナルの強度比を比較することで行った。定量では2桁程度の直線性が見られ、半定量するにあたって、十分な直線性を持っていると考えられた。一方、チロシンリン酸化タンパク質を回収するための抗チロシンリン酸化抗体を利用した回収方法については検討中である。