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豚脳脈絡絨毛上皮細胞に存在するClチャンネルのクローニングおよび電気生理学的検討

猪脑脉络膜绒毛上皮细胞Cl通道的克隆和电生理学研究

基本信息

批准号：
10770021
负责人：
鍜治田英俊
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kansai Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

项目摘要

豚脳室脈絡膜上皮(CP)細胞をCrookらの方法を改変して培養した。パッチクランプ全細胞記録法を用いてCl電流を検討した。細胞内にcAMP依存性プロテインキナーゼの活性サブユニット(PKA C-subunit)を投与すると内向整流性Cl電流が観察された。活性化されたチャネルの陰イオン選択性、細胞外pH感受性、Clチャネルブロッカーへの感受性を検討したところ、ラットやマウスで既に報告したチャネルとほぼ同一の電気生理学的性質を有することが明らかになった。さらにVIPを灌流することによっても内向整流性Cl電流は活性化された。活性化されたチャネルの電気生理学的性質はJentschらのグループがクローニングし報告しているClC2に類似しているため、ClC2チャネルのアンチセンスオリゴヌクレオチド(AS)を作製し、カチオンリポソーム法を用いて培養CP細胞に導入した。AS導入はGFPをマーカーとして蛍光顕微鏡で確認し、約20%の細胞にASは導入されていた。さらに実際のClC2蛋白発現量への効果についてはWestern blotting法を用いて検討し、AS導入によりClC2蛋白の発現が抑制されることを確認した。チャネル機能に対しては蛍光顕微鏡下に導入細胞を選択しCl電流を記録したところ、細胞内にPKA C-subunitを投与しても内向整流性Clチャネルの活性は記録されなかった。ASと同じG/C比をもちアンチセンス作用を持たないように配列を変えたオリゴヌクレオチドではClチャネル活性は維持されることからASによるチャネルの消失は特異的な反応であると考えられた。以上の結果からCPに存在するcAMP依存性内向整流性ClチャンネルにClC2が関与することが推測される。

A new method of culture of choroidal epithelial cells (CP) was developed. The whole cell recording method was used to detect Cl current. Intracellular cAMP-dependent Cl currents are observed. The activity of the enzyme is dependent on the activity of the enzyme, the sensitivity of the enzyme to extracellular pH, and the sensitivity of the enzyme to the activity of the enzyme. VIP perfusion and activation of inward rectifying Cl current The electrophysiological properties of activated cells were similar to those of ClC2 cells reported by Jentsch. ClC2 cells were introduced into CP cells by culture method. As a result, about 20% of the cells were confirmed to have been transfected with GFP by microscopy. The effect of ClC2 protein production in real time was investigated by Western blotting, and the inhibition of ClC2 protein production by AS introduction was confirmed. The function of the cell is to record the Cl current and intracellular PKA C-subunit in the cell under the microscope. AS/C ratio: 0/1/2/3/4/5/6/7/8/9/1 The above results indicate that the existence of CP is cAMP dependent, inward rectifying, and ClC2 dependent.