ラット蝸牛におけるクラドイドチャンネルのRT-PCR法を用いたクローニング

点击翻译按钮获取中文摘要

血管条を含む蝸牛外側壁は、イオンの分泌、吸収が活発に行われ、内耳の内リンパ、外リンパという2つの液性分画の形成に重要であると考えられている。蝸牛外側壁では、多くのイオンチャンネル及び輸送体蛋白質の存在が示唆されてきた。クロライドチャンネルについては、電気生理学的手法により電位非依存性チャンネルの存在が示されているが、電位依存性クロライドチャンネル(CIC)についての研究報告はない。CICは、CIC-1,CIC-2,CIC-3,CIC-4,CIC-5,CIC-K1,CIC-K2の7種類がクローニングされている。今回の研究では、これらCICファミリーを蝸牛外側壁にて同定することを目的とした。内耳組織は細胞数が少ないため、mRNAの検出に感度の高いRT-PCRを用いた。方法:顕微鏡下にラット蝸牛外側壁を取り出し、グラニジンで変性後、オリゴdTセルロースを用いてmRNAを抽出した。逆転写酵素にてcDNAを作製しPCRの鋳型とした。CIC-1,CIC-2,CIC-3に共通の塩基配列を選択しデジェネレートプライマーを合成した。PCR後、ゲルをナイロンフィルターに転写した。各CICに特異なプローブでハイブリダイゼーションを行った。また、PCR産物はプラスミドベクターに挿入後、その塩基配列を確認した。結果及び考察:ラット蝸牛外側壁では、CIC-1は発現せず、CIC-2,CIC-3が検出された。PCR産物の塩基配列を見ると、CIC-2,CIC-3の他にCIC-K1に一致する配列があった。CIC-K1は、従来、腎尿細管の限られた領域にしか発現していないと考えられていたが、今回の研究で蝸牛外側壁にその存在が示されたことは大変興味深い。さらに、in situ hybridizationによる外側壁内での局在を検討中である。