ラット蝸牛におけるクラドイドチャンネルのRT-PCR法を用いたクローニング

RT-PCR法克隆大鼠耳蜗枝状通道

基本信息

批准号：
08771377
负责人：
大島猛史
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08771377/
关键词：
クロライドチャンネル血管条蝸牛 PCR

项目摘要

血管条を含む蝸牛外側壁は、イオンの分泌、吸収が活発に行われ、内耳の内リンパ、外リンパという2つの液性分画の形成に重要であると考えられている。蝸牛外側壁では、多くのイオンチャンネル及び輸送体蛋白質の存在が示唆されてきた。クロライドチャンネルについては、電気生理学的手法により電位非依存性チャンネルの存在が示されているが、電位依存性クロライドチャンネル(CIC)についての研究報告はない。CICは、CIC-1,CIC-2,CIC-3,CIC-4,CIC-5,CIC-K1,CIC-K2の7種類がクローニングされている。今回の研究では、これらCICファミリーを蝸牛外側壁にて同定することを目的とした。内耳組織は細胞数が少ないため、mRNAの検出に感度の高いRT-PCRを用いた。方法:顕微鏡下にラット蝸牛外側壁を取り出し、グラニジンで変性後、オリゴdTセルロースを用いてmRNAを抽出した。逆転写酵素にてcDNAを作製しPCRの鋳型とした。CIC-1,CIC-2,CIC-3に共通の塩基配列を選択しデジェネレートプライマーを合成した。PCR後、ゲルをナイロンフィルターに転写した。各CICに特異なプローブでハイブリダイゼーションを行った。また、PCR産物はプラスミドベクターに挿入後、その塩基配列を確認した。結果及び考察:ラット蝸牛外側壁では、CIC-1は発現せず、CIC-2,CIC-3が検出された。PCR産物の塩基配列を見ると、CIC-2,CIC-3の他にCIC-K1に一致する配列があった。CIC-K1は、従来、腎尿細管の限られた領域にしか発現していないと考えられていたが、今回の研究で蝸牛外側壁にその存在が示されたことは大変興味深い。さらに、in situ hybridizationによる外側壁内での局在を検討中である。

包括纹状体在内的外耳蜗壁被离子积极分泌和吸收，被认为对于形成两个体液级分很重要：内耳的内膜和佩洛尔莱姆普。在外侧耳蜗壁中已经提出了许多离子通道和转运蛋白的存在。关于氯化物通道，电生理技术显示了潜在独立的通道的存在，但尚未报道有关电压依赖性氯化物通道（CICS）的研究报告。克隆了七种CIC：CIC-1，CIC-2，CIC-3，CIC-4，CIC-5，CIC-5，CIC-K1和CIC-K2。这项研究的目的是在侧耳蜗墙上鉴定这些CIC家族。因为内耳组织具有少量的细胞RT-PCR（高度敏感）用于检测mRNA。方法：在显微镜下去除大鼠耳蜗的外壁，用花格丁素变性，并使用寡纤维纤维素提取mRNA。使用逆转录酶制备cDNA以形成PCR模板。选择了CIC-1，CIC-2和CIC-3的共同基序来合成简并底漆。 PCR后，将凝胶转移到尼龙滤镜上。用特定于每个CIC的探针进行杂交。此外，将PCR产物插入质粒载体后，确认了PCR产物的碱基序列。结果和讨论：在大鼠耳蜗的侧壁中未表达CIC-1，检测到CIC-2和CIC-3。查看PCR产物的核苷酸序列，除了CIC-2和CIC-3外，还有与CIC-K1相匹配的序列。人们认为CIC-K1仅在肾小管的有限区域中表达，但是非常有趣的是，在这项研究中，在耳蜗的侧壁中显示了它的存在。此外，目前正在研究通过原位杂交在外壁内的定位。