ウエルシュ菌α毒素の溶血作用に関連する赤血球内情報伝達系の解析

1.α毒素によるウサギ赤血球膜PA合成亢進、及び、溶血に対する低分子量Gタンパク質の影響:ウサギ網状赤血球から単離されたmRNAを基にRT-PCR法によりrho-GDI遺伝子を単離し、この遺伝子を融合タンパク質発現ベクターに挿入、大腸菌におけるrho-GDIの発現系を確立した。そこで、この組換えタンパク質のα毒素によるウサギ赤血球膜PA合成亢進、そして、溶血に対する影響を検討した。その結果、毒素によるPA合成の亢進、そして、溶血は、いずれも組換えrho-GDIの濃度に依存して阻害されることが判明した。このことから、α毒素によるウサギ赤血球膜PA合成の亢進、そして、溶血に低分子Gタンパク質であるrhoの関与が推察される。次に、α毒素の溶血とrhoの関係をさらに明らかにするため、網状赤血球からrho遺伝子を単離し、組換えrhoタンパク質の発現系を構築した。現在、この組み換えタンパク質の毒素の溶血活性に対する影響を検討中である。2.α毒素の溶血活性と赤血球内Ca^<2+>の関係:ウマ赤血球内へ細胞内Ca^<2+>キレート試薬であるBAPTAを取り込ませたBAPTA封入ウマ赤血球を調製し、この赤血球に対するα毒素の溶血活性を検討した。その結果、BAPTA封入赤血球に対して、本毒素の溶血活性は低下することが判明した。3.α毒素の溶血活性と赤血球スフィンゴミエリン(SM)代謝の関係:ウサギ、または、ヒツジ赤血球をα毒素処理したとき、毒素量に依存してセラミド生成が亢進することが明らかになった。次に、枯草菌における組換えセレウス菌スフィンゴミエリナーゼ(SMase)の発現系を構築し、組み換えSMaseを精製した。この組換えSMaseは、ウサギ、そして、ヒツジ赤血球に対して溶血を引き起こす前に血球膜セラミド生成の亢進を引き起こした。このことから、α毒素による赤血球膜のSM分解が毒素による溶血に密接に関連すると推察される。

1.α毒素によるウサギ赤血球膜PA合成亢進、及び、溶血に対する低分子量Gタンパク質の影響:ウサギ網状赤血球から単離されたmRNAを基にRT-PCR法によりrho-GDI遺伝子を単離し、この遺伝子を融合タンパク質発現ベクターに挿入、大腸菌におけるrho-GDIの発現系を確立した。そこで、この組換えタンパク質のα毒素によるウサギ赤血球膜PA合成亢進、そして、溶血に対する影響を検討した。その結果、毒素によるPA合成の亢進、そして、溶血は、いずれも組換えrho-GDIの濃度に依存して阻害されることが判明した。このことから、α毒素によるウサギ赤血球膜PA合成の亢進、そして、溶血に低分子Gタンパク質であるrhoの関与が推察される。次に、α毒素の溶血とrhoの関係をさらに明らかにするため、網状赤血球からrho遺伝子を単離し、組換えrhoタンパク質の発現系を構築した。現在、この組み換えタンパク質の毒素の溶血活性に対する影響を検討中である。2.α毒素の溶血活性と赤血球内Ca^<2+>の関係:ウマ赤血球内へ細胞内Ca^<2+>キレート試薬であるBAPTAを取り込ませたBAPTA封入ウマ赤血球を調製し、この赤血球に対するα毒素の溶血活性を検討した。その結果、BAPTA封入赤血球に対して、本毒素の溶血活性は低下することが判明した。3.α毒素の溶血活性と赤血球スフィンゴミエリン(SM)代謝の関係:ウサギ、または、ヒツジ赤血球をα毒素処理したとき、毒素量に依存してセラミド生成が亢進することが明らかになった。次に、枯草菌における組換えセレウス菌スフィンゴミエリナーゼ(SMase)の発現系を構築し、組み換えSMaseを精製した。この組換えSMaseは、ウサギ、そして、ヒツジ赤血球に対して溶血を引き起こす前に血球膜セラミド生成の亢進を引き起こした。このことから、α毒素による赤血球膜のSM分解が毒素による溶血に密接に関連すると推察される。