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ウエルシュ菌α毒素のリン脂質代謝亢進に関与するGTP結合タンパク質の解析

分析参与产气荚膜梭菌 α-毒素磷脂代谢增加的 GTP 结合蛋白

基本信息

批准号：
07770211
负责人：
越智定幸
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Tokushima Bunri University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1)α毒素によるウサギ赤血球膜中でのホスファチジン酸(PA)合成亢進に関与するGTP結合タンパク質(Gタンパク質)の分子種を明らかにするため、ウシ脳ホモジネイトから三量体Gタンパク質の精製を行った。ウシ脳ホモジネイトを遠心して得られる細胞膜をコール酸ナトリウムで可溶化し、この可溶化物を出発材料として、DEAE-セファセル、及び、セファクリルS-300(HR)カラムクロマトグラフィーを行い、[^<35>S]GTPγSに結合能を有するGタンパク質(Gs、Gi)標品を得た。しかしながら、この画分には、若干他のタンパク質の混在が認められたので、さらに精製を進行中である。また、この部分精製標品を用いて、その効果を検討している。2)α毒素によるウサギ赤血球膜PA合成亢進とチロシンキナーゼの関係を明らかにするため、チロシンキナーゼ阻害剤の影響を検討した。メチル2,5-ジヒドロキシシンナメート、及び、RCM-リゾチームは、用量依存的に毒素によるPA合成亢進を阻害することが明らかとなった。3)α毒素のPA合成を増強する赤血球細胞質中の因子の精製を行った。赤血球細胞質に硫安を加え、この硫安画分を出発材料とし、セファクリルS-300(HR),DEAE-セファロース、そして、銅キレートアフィニティーカラムクロマトグフィーを行った。銅キレートアフィニティーカラムで溶出した活性画分は、[^<35>S]GTPγS結合能を有する分子量約24KDa、及び、10KDaのタンパク質を含んでいた。従って、この反応系に関与するこのGタンパク質は、低分子量Gタンパク質であると推察された。次に、他の細胞系において、PA合成系に関与するホスフォリパーゼDをRhoタンパク質(Rho)が活性化することから、RhoのADP-リボシル化酵素として知られているC3ボツリヌス酵素、または、EDINで処理したが、不活性化されなかった。そこで、この増強因子は、ARF様タンパク質と推察されるので、酵母から、PCR法によってARF遺伝子を単離し、大腸菌にトランスフォームした。現在、毒素によるPA合成亢進に対するARFの効果を検討中である。

1)α toxin production in red blood cell membrane is related to the synthesis of GTP binding protein (GTP) and the purification of GTP binding protein. The cell membrane of the cell membrane was isolated from the cell membrane, and the solubilized substance was isolated from the cell membrane. The solubilized substance was isolated from the cell membrane. The DEAE-C-S-300(HR)-C-<35>C The painting is divided into several parts, and some other parts are mixed in the recognition and refinement. This part of the refined standard is used in the process and the results are discussed. 2) The relationship between alpha toxin and PA synthesis in erythrocyte membrane was studied. 2, 5-D, 5-D, 5-D, 3) PA synthesis of alpha toxin was enhanced, and factors in erythrocyte cytoplasm were purified. Red blood cell cytosol sulfur content increase, sulfur content release material, DEAE-S-300(HR), DEA-S-300(HR), DE The <35>dissolution activity of copper is determined by the binding energy of [^ S]GTPγS. The molecular weight is about 24KDa, and the molecular weight is about 10KDa. The relationship between molecular weight and molecular weight is discussed. In addition, other cell lines, PA synthesis system related to the activation of Rho, Rho ADP-containing enzyme The ARF gene is isolated by PCR, and the E. coli gene is isolated by PCR. Now, the effect of ARF on PA synthesis is discussed.