アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質の変異導入による機能解析

通过诱变对腺相关病毒 Rep 蛋白进行功能分析

• 批准号: 10770134
• 负责人: 卜部 匡司
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Jichi Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10770134/
• 关键词: アデノ随伴ウイルス; Rep蛋白質; 部位特異的組込み; アラニンスキャンニング変異導入

昨年度に実施した、アデノ随伴ウイルス(AAV)のRep蛋白質の変異導入による解析により、細胞毒性が減弱しているEK57AA、RD61AA、R122A、R185A、E201Aの計5クローンを同定した。これら5クローンが本当に野生型Rep蛋白質と同程度のAAVS1特異的組込み活性を保持しているか詳細に調べるため、AAVのinverted terminal repeat(ITR)配列ではさんだNeo遺伝子プラミスドと変異Rep蛋白質発現プラミスドを293細胞にトランスフェクションし、G418存在下で培養を行った。そこから得られたクローンをランダムに拾いそれらのサザン解析を行い、Neo遺伝子がAAVS1領域に組込まれている頻度を検討した。野生型Repを用いた場合は60%(12/20)のクローンでAAVS1特異的組込みが認められ、E201Aを用いた場合、89%(25/28)のクローンでAAVS1特異的組込みが確認できた。一方、その他のEK57AA、RD61AA、R122A、R185Aを用いた場合はAAVS1特異的組込みを示したクローンの頻度は20%以下であった。以上のことは、E201Aが野生型Repと同程度、もしくは、より高い部位特異的活性を保持していることを示しており、細胞毒性が減弱していることと考え合わせ、染色体の特定の部位に任意の外来性遺伝子を導入するテクノロジーにより適している可能性があると考えられる。

In the past year, the effects of different introduction of Rep protein with AAV were studied, and the cytotoxicity of EK 57AA, RD 61AA, R122A, R185A and E201A was reduced. The wild-type Rep protein was maintained at the same level of AAVS1-specific component activity as the native wild type Rep protein, and the inverted terminal repeat(ITR) of AAV was aligned with the Neo gene. The heteroRep protein was produced in 293 cells and cultured in the presence of G418. For example, if you want to find out how often you want to find out how to find out. AAVS1-specific groups were identified in 60%(12/20) of cases where wild-type Rep was used, and 89%(25/28) of cases where E201A was used. The frequency of AAVS1-specific group is less than 20% in the case of one party, other EK 57AA, RD 61AA, R122A and R185A. E201A wild-type Rep has the same degree of activity as E201A wild-type Rep, and its high site-specific activity is maintained.

项目成果

Ogasawara. Y.: "Efficient production of adeno-associated virus vectors using split-type helper plasmids" Jpn.J.Cancer Res.(in press).

小笠原。

Kodaira,H.: "Fas and mutant estrogen receptor chimeric gene: a novel suicide vector for tamoxifen-inducible apoptosis" Jpn.J.Cancer Res.89. 741-747 (1998)

Kodaira,H.：“Fas 和突变雌激素受体嵌合基因：一种用于他莫昔芬诱导细胞凋亡的新型自杀载体”Jpn.J.Cancer Res.89。

Maeda, Y.: "Efficient gene transfer into cardiac myocytes using adeno-associated virus(AAV)vectors" J.Mol.Cell.Cardiol.30. 1341-1348 (1998)

Maeda, Y.：“使用腺相关病毒 (AAV) 载体将基因有效转移到心肌细胞”J.Mol.Cell.Cardiol.30。

Ogasawara, Y.: "The use of heterologous promoters for adeno-associated virus(AAV)protein expression in AAV vector production" Microbiol.Immunol.42. 177-185 (1998)

Ogasawara, Y.：“在 AAV 载体生产中使用异源启动子进行腺相关病毒 (AAV) 蛋白表达”Microbiol.Immunol.42。

Urabe,M.: "A switching system regulating subcellular localization of unclear proteins using a viral protease"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 266. 92-96 (1999)

Urabe,M.：“使用病毒蛋白酶调节不清楚蛋白质的亚细胞定位的转换系统”Biochem.Biophys.Res.Commun.. 266. 92-96 (1999)