アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質を用いた部位特異的遺伝子導入

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アデノ随伴ウイルスのコンポーネントであるRep蛋白質とITR配列を利用しての第19番染色体AAVS1領域への部位特異的外来性遺伝子導入法を確立するため、4種類あるRep蛋白質(Rep78、68、52、40)のうちどれがAAVS1への特異的組込み活性を持つか調べた。個々のRepを単独で発現するプラスミドと、ITR配列で挟んだネオマイシン耐性遺伝子(Neo^r)発現ユニットを持つプラスミドを作製し、それらを同時に293細胞にトランスフェクトし、AAVS1領域へのNeo^rプラスミドの特異的組込みの有無をPCRを応用した検出法により検討した。その結果、Rep78、68がAAVS1への組込み活性を持つことを明らかにした。さらに、トランスフェクトした細胞をG418で選択を行い、コロニーを形成させ、個々のクローンをサザンブロット法、FISHにてNeo^rの19番染色体AAVS1領域への組込みの有無を解析した。コントロールとしてRepプラスミドの代わりにブランクベクターを用いた場合、10クローン解析したうち、AAVS1領域への組込みを示したクローンはなかったが、Rep78、68を用いた場合それぞれ4/10、1/8に部位特異的組込みが認められた。つまりRep78の方がRep68より、より部位特異的にNeo^rを組み込むことが判った。今後は、さらに部位特異的組込み効率を上げるため、過剰に発現させると細胞毒性を示すRep蛋白質の発現量を調節するシステムを導入し、より安全性の高い染色体DNAへの部位特異的組み込み法を確立したい。