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アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質を用いた部位特異的遺伝子導入

使用腺相关病毒 Rep 蛋白进行位点特异性基因转移

基本信息

批准号：
08770221
负责人：
卜部匡司
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Jichi Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08770221/
关键词：
アデノ随伴ウイルス Rep蛋白質部位特異的遺伝子導入 AAVS1領域

项目摘要

アデノ随伴ウイルスのコンポーネントであるRep蛋白質とITR配列を利用しての第19番染色体AAVS1領域への部位特異的外来性遺伝子導入法を確立するため、4種類あるRep蛋白質(Rep78、68、52、40)のうちどれがAAVS1への特異的組込み活性を持つか調べた。個々のRepを単独で発現するプラスミドと、ITR配列で挟んだネオマイシン耐性遺伝子(Neo^r)発現ユニットを持つプラスミドを作製し、それらを同時に293細胞にトランスフェクトし、AAVS1領域へのNeo^rプラスミドの特異的組込みの有無をPCRを応用した検出法により検討した。その結果、Rep78、68がAAVS1への組込み活性を持つことを明らかにした。さらに、トランスフェクトした細胞をG418で選択を行い、コロニーを形成させ、個々のクローンをサザンブロット法、FISHにてNeo^rの19番染色体AAVS1領域への組込みの有無を解析した。コントロールとしてRepプラスミドの代わりにブランクベクターを用いた場合、10クローン解析したうち、AAVS1領域への組込みを示したクローンはなかったが、Rep78、68を用いた場合それぞれ4/10、1/8に部位特異的組込みが認められた。つまりRep78の方がRep68より、より部位特異的にNeo^rを組み込むことが判った。今後は、さらに部位特異的組込み効率を上げるため、過剰に発現させると細胞毒性を示すRep蛋白質の発現量を調節するシステムを導入し、より安全性の高い染色体DNAへの部位特異的組み込み法を確立したい。

A site-specific alien gene introduction method was established for Rep protein and ITR alignment using the AAVS1 domain of chromosome 19. Four types of Rep proteins (Rep78, 68, 52, 40) were identified and their activities were modulated using the AAVS1 domain specific gene. The presence or absence of a specific set of primers for Rep 1, Rep 2, Rep 3, Rep 4, Rep 5, Rep 6, Rep 7, Rep 8, Rep 9, Rep 10, Rep 11, Rep 12, Rep 13, Rep 14, Rep 15, Rep 16, Rep 17, Rep 18, Rep 19, Rep 10, Rep 19, Rep 10, Rep 10, Rep Results: Rep78, Rep 68, Rep78, Rep 78, Rep 78, In addition, the expression of Neo^r in chromosome AAVS1 domain was analyzed by FISH. In the case of Rep. 78, Rep. 68, Rep. 78, Rep. 78, RepつまりRep78の方がRep68より、より部位特异的にNeo^rを组み込むことが判った。In the future, site-specific organization methods will be established to increase the rate of detection, increase the level of cytotoxicity, and regulate the production of Rep protein.