新しい自己免疫性水疱症と思われる粘膜限局性IgA天疱瘡における抗原の同定

粘膜局部 IgA 天疱疮(一种新的自身免疫性大疱性疾病)中抗原的鉴定

基本信息

  • 批准号:
    10770408
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.15万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
  • 财政年份:
    1998
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1998 至 1999
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

免疫ブロット法(平成10年度)方法自己抗体の性状の確認のため、免疫ブロット法を先行した。EDTA剥離正常ヒト表皮および正常ヒト培養表皮細胞から蛋白分画を抽出し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動にて流した蛋白をニトロセルロース膜に転写する。患者血清、IgA分画のみの患者血清を1次抗体として、ABC法で反応させ、ケミルミネッセンス法にて陽性バンドを同定した。結果通常のプロット法では陽性バンドが検出されなかったため、サンプルの濃度を上げる、washingを念入りに行う、露光時間を上げる等の処置を加えたところ、200kD付近にIgAに反応する陽性バンドが認められた。しかしながらサンプル量があまりにも少量であったため陽性バンドから抽出した分画を用いた蛍光抗体間接法は施行できなかった。このことから血清中に自己抗体が存在するものと考え、次の免疫電顕法に進んだ。免疫電顕法(平成11年度)方法平成10年度から引き続き免疫電顕法を施行した。患者結膜、正常人結膜、正常人皮膚を固定した後レジン包埋した。ウルトラミクロトームにて超薄切片作製後、抗ヒトIgA抗体、患者血清を1次抗体として、ABC法を用いコロイド金にてラベリングし、透過型電子顕微鏡(JEOL,JEM-100SX)にて観察した。免疫スクリーニング法(平成11年度)方法正常ヒト結膜細胞、正常ヒト表皮細胞よりmRNAを抽出、逆転写反応にて合成されたcDNAをλgt11発現ベクターにサブクローニングする。発現ベクターを吸着させた宿主菌Y1090のコロニーのプラークリフティングを行い、精製された患者IgA分画血清を1次抗体として免疫染色を行う。陽性コロニーを取り出した後増殖、cDNAを抽出し、塩基配列を決定する。結果正常ヒト皮膚の表皮細胞間にわずかながらコロイド金のラベリングが認められた。しかしながら、ラベリングの分布特性がはっきりしなかったため、患者血清のIgA分画を用いて再度免疫電顕法を施行したが、前回以上の所見は得られなかった。原因としては患者血清中の自己抗体価が非常に低かった、あるいはサンプル量自体が少なく免疫スクリーニング法等の実験の継続が困難であったことなどが考えられる。以上のことから本患者血清には上皮細胞間の成分を認識する自己抗体分画が存在することは非常に強く示唆されるが、認識される抗原の分布特性や正常を確定するまでには至らなかった。
Immunization method (Heisei 10 years) method to confirm the characteristics of their own antibodies, immunization method to advance EDTA stripped normal epidermis and normal cultured epidermis cells from protein extraction, SDS electrophoresis, electrophoresis, protein extraction, and membrane electrophoresis Patient serum, IgA assay, and patient serum were tested for primary antibodies, ABC assay, and IgA assay. The results are usually positive, negative, negative, positive, negative, positive, negative, negative, positive, negative, negative, A small amount of light is used to extract light. The presence of self-antibodies in the serum of these patients was detected by ELISA, and the immune response was improved by ELISA. Immunoelectric method (Heisei 11) Method Heisei 10 began to introduce the immunoelectric method. The conjunctiva of the patient, the conjunctiva of the normal person and the skin of the normal person are fixed and embedded. After ultra-thin section preparation, anti-IgA antibody, primary antibody in patient serum, ABC method, transmission electron microscope (JEOL,JEM-100SX) were used for observation. Immunohistochemical method (Heisei 11) Method Normal conjunctival cells, normal epidermal cells, mRNA extraction, reverse transcription, reverse transcription, synthesis of cDNA, λgt11, development of DNA. The host bacterium Y1090 was detected and purified. The patient IgA serum was detected by primary antibody and immunostaining. DNA extraction and gene sequencing Results Normal skin epidermal cells were separated from each other. The distribution characteristics of IgA in patients 'serum were analyzed by re-immunization. The reason is that the antibody level in the patient's serum is very low, and the antibody level is very low. The above results show that the distribution of antibodies among epithelial cells in the serum of patients is very strong and normal.

项目成果

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