一酸化窒素センサー蛋白質グアニル酸シクラーゼの分子内情報伝達機構の解明

阐明一氧化氮传感器蛋白鸟苷酸环化酶的分子内信号转导机制

• 批准号: 12780461
• 负责人: 尾林 栄治
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12780461/
• 关键词: 一酸化窒素; グアニル酸シクラーゼ; 大腸菌大量発現系; 蛋白質結晶化; ヘム結合部位; cGMP合成部位; X線結晶構造解析

一酸化窒素(NO)センサー蛋白質グアニル酸シクラーゼ(sGC)は、NO結合により活性化され、GTPからcGMPを合成する。本研究では、本蛋白質の発現系の構築や共鳴ラマン分光法、部位特異的変異体を調製することにより、NOによるsGCの活性化制御機構を明らかにすることを目的としている。さらに、sGCのX線結晶構造解析も目指した。本年度は昨年度同様、多量のサンプルを要する本蛋白質の結晶化条件の検索を行うために、申請者は本蛋白質の大量発現系の構築を行った。申請者は、すでにNOの結合するsGCのヘム結合部位のみの大腸菌による発現に成功していたが、安定で均一な蛋白質を得ることができなかったために、良質な結晶を得ることができなかった。そこで培養・精製条件をさらに精密に検索したところ、安定な蛋白質を取ることに成功した。現在このサンプルを用いて結晶化条件を検索中である。また、昨年度成功しなかった本蛋白質の全長であるヘテロ二量体の発現系の構築は、さらなる培養条件の検索のみでなく、可溶性蛋白質をフュージョンさせ、発現後取り去る方法や、大腸菌内にInclusion Bodyとして発現されたペプチド鎖を天然の形に巻き戻すなどの方法も試みたが、いずれの場合にも良い結果は得られなかった。大腸菌による蛋白質発現系は、酵母やバキュロウイルスを用いるよりも安価で、かつ大量な試料を短時間で発現させることができるが、哺乳類由来の蛋白質の発現には向かないことが多い。今後さらなる大腸菌発現系の技術開発が期待される。

The acidification smothering element (NO) セ ン サ ー protein グ ア ニ ル acid シ ク ラ ー ゼ は (sGC), NO combination に よ り activeness さ れ, GTP か made ら cGMP を synthetic す る. This study で は, this protein の 発 now is の build や resonance ラ マ ン spectrometry, site specific - variant を modulation す る こ と に よ り, NO に よ る sGC の activation system royal institution を Ming ら か に す る こ と を purpose と し て い る. Youdaoplaceholder0, analysis of the X-ray crystal structure of sGC さらに index: た た. This year's annual は yesterday with others, more quantity の サ ン プ ル を to す る の this protein crystallization conditions の 検 cable line を う た め に, applicants は this protein の a lot 発 now is の line build を っ た. Applicants は, す で に NO の combining す る sGC の ヘ ム combining site の み の coliform に よ る 発 に now successful し て い た が, settle で uniform な protein を る こ と が で き な か っ た た め に, good quality な crystallization を る こ と が で き な か っ た. そ こ で culture conditions, the refined を さ ら に precision に 検 cable し た と こ ろ, stable な protein を take る こ と に successful し た. Now <s:1> サ プ プ を を を crystallize under the を検 て conditions を検 in である. ま た, yesterday year successful し な か っ た over this protein の で あ る ヘ テ ロ 2 quantity body の 発 is の build は, さ ら な る culture conditions の 検 cable の み で な く, soluble protein を フ ュ ー ジ ョ ン さ せ や, り 発 now after る method, coliform に Inclusion Body と し て 発 now さ れ た ペ プ チ ド lock の を natural shape に 巻 き 戻 す な ど の way も try み た が, い ず れ の occasions に い も good results ら は れ な か っ た. Coliform に よ る 発 now は, yeast protein や バ キ ュ ロ ウ イ ル ス を with い る よ り も Ann 価 で, か つ large な sample を short で 発 now さ せ る こ と が で き る が, mammals origin の protein の 発 now に は to か な い こ と が い more. In the future, the development of さらなる coliform bacteria technology will be が and we look forward to される.