融合タンパク質による電子顕微鏡用分子ラベルの開発

本研究課題では,目的タンパク質の特定部位に金属タンパク質を融合させることによる電子顕微鏡用部位特異的分子ラベルの開発を行っている.計画としては,(1)ラベル用金属タンパク質としてメタロチオネインを数分子つなげたポリメタロチオネイン遺伝子を作製し,これを発現・精製した後,金属イオンを取り込ませて電子顕微鏡下で観察し,ラベルとして最適なメタロチオネインの数を推定する,(2)適当な長さのポリメタロチオネイン遺伝子をキネシン重鎖遺伝子の下流に結合し,これを発現・精製した後,微小管の表面に密に結合させて,金属イオンでラベルした後電子顕微鏡で観察し,ラベルの効率,分解能を評価するというものである.本年度の計画として,まず(1)のポリメタロチオネイン遺伝子を作製するため,クローンプラスミドからヒトメタロチオネイン遺伝子を切りだし,これにグリシンを3残基コードするタグを付けて一挙にベクターへの挿入を行った.しかし,この方法では何故か上手くポリメタロチオネイン遺伝子をクローニングすることが出来なかった.そこで,方法を変えて,タグとしてのグリシン3残基とその下流に一過性のクローニングサイトを導入した目的遺伝子のプライマーを合成し,PCR法によって目的遺伝子のインサートを作製して,これをタンパク発現ベクターにクローニングすることにした.この方法では,一回のラーゲーションによって確実に1個のメタロチオネインが挿入され,この操作を繰り返すことによって目的の長さのポリメタロチオネインを作製することが出来る.さらに,これを最初キネシン遺伝子のクローニングから行うことにより,一挙に(1)と(2)の検証が可能となる.現在,合成したプライマーよりタグと一過性クローニングサイトを持ったキネシンインサートをPCR法により作製し,このクローニングを行っているところである.

本研究課題では,目的タンパク質の特定部位に金属タンパク質を融合させることによる電子顕微鏡用部位特異的分子ラベルの開発を行っている.計画としては,(1)ラベル用金属タンパク質としてメタロチオネインを数分子つなげたポリメタロチオネイン遺伝子を作製し,これを発現・精製した後,金属イオンを取り込ませて電子顕微鏡下で観察し,ラベルとして最適なメタロチオネインの数を推定する,(2)適当な長さのポリメタロチオネイン遺伝子をキネシン重鎖遺伝子の下流に結合し,これを発現・精製した後,微小管の表面に密に結合させて,金属イオンでラベルした後電子顕微鏡で観察し,ラベルの効率,分解能を評価するというものである.本年度の計画として,まず(1)のポリメタロチオネイン遺伝子を作製するため,クローンプラスミドからヒトメタロチオネイン遺伝子を切りだし,これにグリシンを3残基コードするタグを付けて一挙にベクターへの挿入を行った.しかし,この方法では何故か上手くポリメタロチオネイン遺伝子をクローニングすることが出来なかった.そこで,方法を変えて,タグとしてのグリシン3残基とその下流に一過性のクローニングサイトを導入した目的遺伝子のプライマーを合成し,PCR法によって目的遺伝子のインサートを作製して,これをタンパク発現ベクターにクローニングすることにした.この方法では,一回のラーゲーションによって確実に1個のメタロチオネインが挿入され,この操作を繰り返すことによって目的の長さのポリメタロチオネインを作製することが出来る.さらに,これを最初キネシン遺伝子のクローニングから行うことにより,一挙に(1)と(2)の検証が可能となる.現在,合成したプライマーよりタグと一過性クローニングサイトを持ったキネシンインサートをPCR法により作製し,このクローニングを行っているところである.