GFP融合タンパク質によるIP_3受容体の可視化とその分布変化の解析

使用GFP融合蛋白可视化IP_3受体并分析其分布变化

• 批准号: 13771101
• 负责人: 森田 貴雄
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Health Sciences University of Hokkaido
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13771101/
• 关键词: IP3受容体; GFP; 細胞内局在; 可視化

イノシトール1,4,5-三リン酸受容体(IP_3R)は細胞内Ca^<2+>ストアからのCa^<2+>放出の重要な担い手であり、その細胞内分布は主に免疫組織化学法を用いて解析されてきた。本研究は、Green Fluorescent Protein (GFP)とラットIP_3Rとの融合タンパクを作製し、これを生きた細胞に発現させてその細胞内局在を可視化し、Ca^<2+>シグナルとの関係を解析することを試みた。GFP-IP_3R3融合タンパクを発現させるプラスミドベクターをヒト唾液腺培養細胞に導入し、この融合タンパクを恒常的に発現する細胞を作製した。この細胞においても、GFP蛍光は核を除く細胞質内にほぼ均一に発現していた。ウェスタンブロット解析の結果、内在性のIP_3R-3より分子量の大きなGFP-IP_3R3融合タンパクが検出された。これらのことから、この細胞は完全長のGFP-IP_3R3融合タンパクを発現していることが示唆された。GFP-IP_3R3融合タンパクが機能的IP_3Rとして働くかを確かめるために、3種類のIP_3Rをすべて発現していない変異細胞(DT40-IP_3RKO)にこの融合ベクターを導入し、融合タンパクを発現させた。これらの細胞をアゴニストで刺激し、Ca^<2+>応答を解析した。GFP-IP_3R3融合タンパクを発現した細胞でのみ細胞内Ca^<2+>上昇が観察され、この上昇は外液Ca^<2+>非存在下で起こることから、細胞内ストアからのCa^<2+>放出が起こることが示唆された。これらの結果から、GFP-IP_3R3融合タンパクが機能的なIP_3Rとして働くことが示唆され、IP_3Rの局在とシグナル応答との関係をリアルタイムで解明するのに有用な道具になる。また、GFP-IP_3R3融合タンパクを発現させた細胞をアゴニストで刺激したところ、細胞内Ca^<2+>上昇は起こったが、GFP蛍光の局在に大きな変化は見られなかった。

IP_3R plays an important role in intracellular Ca^<2 +> release and its intracellular distribution was analyzed by immunohistochemistry. In this study, Green Fluorescent Protein (GFP) and IP_3R were used to visualize and analyze the relationship between the fusion protein and IP_3R in living cells. GFP-IP_3R3 fusion protein development was introduced into salivary gland culture cells, and the fusion protein development was constantly performed in cells. The cells were irradiated with GFP and the nucleus was removed from the cytoplasm. The results of molecular weight analysis, intrinsic IP_3R-3 fusion analysis and GFP-IP_3R-3 fusion analysis were obtained. The cells were completely fused with GFP-IP_3R_3. GFP-IP_3R3 Fusion IP_3R and IP_3R of fusion function are introduced into and developed from DT40-IP_3RKO, three kinds of IP_3R are developed. The cells were stimulated and Ca^<2+> was analyzed. GFP-IP_3R_3 fusion protein was detected in the cells and the intracellular Ca^<2+> increased. In the absence of Ca^<2+>, the intracellular Ca^<2 +> released. As a result, GFP-IP_3R_3 fusion technology has been successfully applied in the field of IP_3R, IP_3R and IP_3R. GFP-IP_3R_3 fusion protein was found in the cells, and the intracellular Ca ~(2+) increased.

项目成果

Takao Morita, Akihiko Tanimura, Akihiro Nezu, Yosuke Tojyo: "Visualization of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type III with green fluorescent protein in living cells"Cell Calcium. 31. 59-64 (2002)

Takao Morita、Akihiko Tanimura、Akihiro Nezu、Yosuke Tojyo：“活细胞中肌醇 1,4,5-三磷酸受体 III 型与绿色荧光蛋白的可视化”细胞钙。