生物学的輸送媒体を介したsiRNA細胞内導入方法の技術的検討

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目的siRNAを細胞内に導入する方法として,siRNAと静電的に結合すると考えられる塩基性核蛋白protamineをtransferrin受容体のリガンドであるtransferrin蛋白に遺伝子組換え技術で融合させ,受容体を介したエンドサイトーシスによってsiRNAを細胞内に導入する技術的な課題の検討を行なった。方法1.protamineと同様に陽電荷を持つ塩基性ペプチド(ポリ-L-リジン)とsiRNAをミックスして電気泳動を行い,siRNAと塩基性ペプチドの結合の有無を電気泳動のバンドの変化より観察した。2.transferrinと塩基性核蛋白protamineの融合蛋白質作製ベクターを遺伝子組換え技術で作製し、そのベクター配列依存的な蛋白質を無細胞蛋白合成系により作製し、その品質を免疫学的方法で確認した。3.transferrinとEGFPが結合した融合タンパクを遺伝子操作法と無細胞蛋白合成系により作製し,培養細胞の培養液の中に添加し、数時間培養。その後,レーザー顕微鏡を用いてtransferrin-EGFP融合蛋白の動向を観察した。結果1.塩基性ペプチドとsiRNAをミックスして電気泳動を行うと,siRNA単独で泳動したバンドより上にシフトした。これよりsiRNAと塩基性ペプチドが静電的に結合することが確認できた。2.Transferrinと塩基性核蛋白protamineの融合蛋白は作製できたが,その生成量はprotamineを融合しないものと比べて少なかった。その原因としてprotamineの強いプラスチャージが蛋白の合成を阻害している可能性がある。今後,塩基性蛋白の代わりに酸性蛋白を用いるなど新たな方法も含め更に検討と改良が必要である。3.レーザー顕微鏡を用いた観察により,transferrin-EGFP融合蛋白が培養細胞の細胞膜に局在している様子が観察された。組換えtransferrin-EGFP融合蛋白がtransferrin受容体に特異的に結合したと考えられる。