癌特異的転写後調節を利用した癌診断技術の開発

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[目的]最近、解糖系律速酵素のひとつであるピルビン酸キナーゼ(pyruvate kinase type-muscle 2 : PKM2)遺伝子の遺伝子発現が癌細胞の増殖に密接に関係していることが報告された(Christofk et al., Nature, 2008)。興味深いことに、PKM2遺伝子は2つのアイソフォームを選択的スプライシングによって産生し、正常組織ではエクソン9を含むPKM1、ほとんど全ての癌組織ではエクソン10を含むPKM2が選択されるようになる。申請者は、PKM2遺伝子の選択的スプライシングを生体内で可視化することにより、どの組織で細胞が癌化しているのかを容易に解析する技術を開発し、その技術の診断への応用を目指して研究を行った。[方法]本研究では、選択的スプライシングを可視化するために、スプライシングレポーターシステムを構築した。このレポーターは、PKM1を選択した場合には緑色蛍光タンパク質GFP、PKM2を選択した場合には赤色蛍光タンパク質RFPを発現する。レポーターは細胞にトランスフェクションし、蛍光顕微鏡による観察と、RT-PCR法によるRNAの解析を行い、内在性PKM遺伝子のスプライシングパターンと比較することでレポーターを最適化した。[研究成果]申請者は、C2C12細胞を用いてPKM2レポーターを評価した。C2C12細胞は分化誘導が可能なマウス筋芽細胞であり、未分化状態ではPKM2、分化状態ではPKM1を選択している。PKM2レポーターをC2C12細胞へ導入したところ、分化依存的にRFPからGFPへの切換えが見られた。このことから、PKM2レポーターは内在性PKM遺伝子のスプライシングを模擬し、細胞内のスプライシング反応を可視化できたと判断した。現在、個体レベルでシグナルを検出しやすくするためにRFP-GFPの代わりに高感度で生体内を透過しやすいCBRluc(クリックビートル由来赤色ルシフェラーゼ遺伝子)を挿入したPKM2レポーターを作製して評価を行っているところである。本研究で構築したシステムは、マウスやアフリカツメガエルといった個体レベルでの細胞の癌化、発生におけるスプライシング変化のライブイメージングに適応可能であり、さらには抗がん剤のスクリーニングやRNAiライブラリーを用いたスプライシング制御因子の探索にも応用できるため、今後の発展が期待される。