SEM-EDX法を用いた元素分布解析の為の生物試料作製法の検討

本研究では、SEM-EDX法を用いて生物試料の微細領域における元素分布のマッピングを行うための試料作成法について検討した。①試料の急速凍結固定および凍結乾燥 :電子顕微鏡下で試料を観察するためには、試料が乾燥していなければならない。通常、生物試料は化学的な固定、有機溶媒による脱水、乾燥という手順により作成されるが、この過程で試料内の成分の一部は流出してしまう。そこで、試料を5, 000K/sec以上の速度で微細構造の変化のないまま凍結し、その後、極低温・高真空下で凍結試料を乾燥する事により、試料内成分の流出を最小限に抑えた。②乾燥試料の樹脂への包埋 :EDX法は検出感度が比較的低いため、詳細な解析を行うためには長時間の測定、即ち、電子ビームの照射が必要となる。生物試料は電子ビームやその照射に伴う熱により変形し易い。そのため、凍結乾燥した試料は導電性樹脂へと包埋し、測定中の変形を防いだ。③樹脂包埋試料の平滑化 :EDX法による微量元素解析では、試料表面に凹凸がない事が望ましい。これは、検出器側を向いた斜面ではバックグランドが高く測定され、逆側では低いためである。微量な元素由来の特性X線シグナルがバックグラウンドの“ムラ”に埋没してしまわないよう、樹脂包埋した試料はダイヤモンドナイフを用いて表面を平滑化した。④SEM-EDX法による元素分布のマッピングとその評価 :以上の手法により得られた試料から各元素の分布のマッピングを行い、空間分解能や検出感度を評価した。なお、平滑化した試料では通常のSEM像を得られないため、電子顕微鏡画像の取得には反射電子検出器を用いた。

本研究では、SEM-EDX法を用いて生物試料の微細領域における元素分布のマッピングを行うための試料作成法について検討した。①試料の急速凍結固定および凍結乾燥 :電子顕微鏡下で試料を観察するためには、試料が乾燥していなければならない。通常、生物試料は化学的な固定、有機溶媒による脱水、乾燥という手順により作成されるが、この過程で試料内の成分の一部は流出してしまう。そこで、試料を5, 000K/sec以上の速度で微細構造の変化のないまま凍結し、その後、極低温・高真空下で凍結試料を乾燥する事により、試料内成分の流出を最小限に抑えた。②乾燥試料の樹脂への包埋 :EDX法は検出感度が比較的低いため、詳細な解析を行うためには長時間の測定、即ち、電子ビームの照射が必要となる。生物試料は電子ビームやその照射に伴う熱により変形し易い。そのため、凍結乾燥した試料は導電性樹脂へと包埋し、測定中の変形を防いだ。③樹脂包埋試料の平滑化 :EDX法による微量元素解析では、試料表面に凹凸がない事が望ましい。これは、検出器側を向いた斜面ではバックグランドが高く測定され、逆側では低いためである。微量な元素由来の特性X線シグナルがバックグラウンドの“ムラ”に埋没してしまわないよう、樹脂包埋した試料はダイヤモンドナイフを用いて表面を平滑化した。④SEM-EDX法による元素分布のマッピングとその評価 :以上の手法により得られた試料から各元素の分布のマッピングを行い、空間分解能や検出感度を評価した。なお、平滑化した試料では通常のSEM像を得られないため、電子顕微鏡画像の取得には反射電子検出器を用いた。