新しい骨形成タンパク質(BMP-3b)の生体における生理作用及び作用機序の解明

阐明新型骨形态发生蛋白（BMP-3b）在活体内的生理效应和作用机制

• 批准号: 08771167
• 负责人: 日野 純
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: National Cardiovascular Center Research Institute
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08771167/
• 关键词: BMP; 骨形成タンパク質

1.昨年申請者らが同定した新規骨形成タンパク質BMP-3bの機能解明を目的に、リコンビナントタクパク質を調製を試みた。(1)一過性発現によるリコンビナントタンパク質の調製COS1細胞にて発現を試み、ウエスタンブロッティングにて発現を確認した。(2)安定発現系によるリコンビナントタンパク質の調製(1)の結果、発現タンパク量が非常に少ないことが判明したので、5種類の宿主細胞の発現を試み、ウエスタンブロッティングにてリコンビナントタンパク質の発現量を検討した。その結果、CHO細胞によるリコンビナントタンパク質が最も多く発現していた(40マイクログラム/リットル)。(3)リコンビナントタンパク質の精製リコンビナントタンパク質をCHO細胞の5リットルの培養上清よりヘパリンセファロース、ConAセファロース、および逆相HPLCにて精製を行った。成熟タンパク質として30マイクログラムおよびプロセッシングの不完全なプロ体タンパク質として170マイクログラムを得た。(4)リコンビナントタンパク質の構造決定リコンビナントタンパク質のN末端アミノ酸配列およびトリプシンにより切断した生成したペプチド断片のアミノ酸配列を解析した。その結果、リコンビナントタンパク質の一次構造はcDNA構造から予想されるアミノ酸配列と完全に一致し、成熟体部分はダイマーを形成していることを確認した。また、C末端の糖鎖の有無によるヘテロダイマーの存在を明らかにした。2.リコンビナント標品を用いてBMP-3bのin vivoでの骨形成活性を検討した。(1)1で調製したリコンビナントタンパク質を用いてラット皮下における異所性骨形成活性を検討した。その結果、9マイクログラムもの大量のリコンビナントタンパク質でも骨形成活性は示さなかった。(2)新生仔ラット頭蓋骨骨膜下における同所性骨形成活性についても検討を行ったが、活性は示さなかった。上記の結果を踏まえて、今後はin vivoの系および骨以外の組織(脳、血管など)における生理作用さらには本因子とBMP-2,4,7などとのヘテロダイマーでの生理活性の検討によりBMP-3bの生理作用解明に取り組んでいきたい。

1. Yesterday in applicants ら が with fixed し た new rules on bone formation タ ン パ ク quality, and the function of BMP - 3 b の interpret を purpose に, リ コ ン ビ ナ ン ト タ ク パ ク qualitative を modulation を try み た. (1) transient 発 now に よ る リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク qualitative の modulation COS1 cells に て 発 を み, now ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ に て 発 を now confirmed し た. (2) settle 発 now に よ る リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク の modulation (1) の result, 発 now タ ン パ ク fewer が very に な い こ と が.at し た の で, 5 kinds の host cell の 発 を み, now ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ に て リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク qualitative の を 発 now quantity beg し 検 た. そ の results, CHO cells に よ る リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク qualitative が more than most も く 発 now し て い た (40 マ イ ク ロ グ ラ ム / リ ッ ト ル). (3) リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク qualitative の refined リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク qualitative を CHO cells の 5 リ ッ ト ル の culture supernatant よ り ヘ パ リ ン セ フ ァ ロ ー ス, ConA セ フ ァ ロ ー ス, お よ び reverse phase HPLC に て refined を line っ た. Mature タ ン パ ク qualitative と し て 30 マ イ ク ロ グ ラ ム お よ び プ ロ セ ッ シ ン グ の incomplete な プ ロ body タ ン パ ク qualitative と し て 170 マ イ ク ロ グ ラ ム を た. (4) リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク qualitative の structure decision リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク qualitative の N terminal ア ミ ノ acid with column お よ び ト リ プ シ ン に よ り cut し た generated し た ペ プ チ ド fragment の ア ミ ノ acid with column を parsing し た. そ の results, リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク qualitative の a tectonic は cDNA structure か ら to think さ れ る ア ミ ノ acid with column と に completely consistent し, mature body part は ダ イ マ ー を form し て い る こ と を confirm し た. Youdaoplaceholder0, whether the c-terminal <s:1> sugar lock plate has によるヘテロダ によるヘテロダ また, によるヘテロダ, を, を, ら, に, た, た. 2. Youdaoplaceholder0 ビナ ビナ ト ト reference material を in vivoで bone formation activity を検 to obtain た. (1) 1 で modulation し た リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク qualitative を with い て ラ ッ ト subcutaneous に お け る bone formed by different active を beg し 検 た. そ の results, 9 マ イ ク ロ グ ラ ム も の large の リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク qualitative で も bone formation active は さ な か っ た. (2) the newborn larvae ラ ッ ト skull subperiosteal に お け る with bone formation by active に つ い て も 検 line for を っ た が, active は さ な か っ た. Written の results を tread ま え て, future は in vivo の is お よ outside の び bone tissue (脳, blood vessels, な ど) に お け る physiology さ ら に は this factor と BMP - 2,4,7 な ど と の ヘ テ ロ ダ イ マ ー で の physiological activity の beg に 検 よ り BMP - 3 b の physiology interpret に group take り ん で い き た い.

项目成果

Hino J.,et al.: "cDNA cloning and genomic structure of humann bone morphogenetic protein 3b (BMP-3b)." Biochem.Biophys.Res.Commun.223. 304-310 (1996)

Hino J.,et al.：“人骨形态发生蛋白 3b (BMP-3b) 的 cDNA 克隆和基因组结构。”

Takao M.,et al.: "Identification of rat bone morphogenetic protein-3b (BMP-3b),a new member of BMP-3." Biochem.Biophys.Res.Commun.219. 656-662 (1996)

Takao M.,et al.：“大鼠骨形态发生蛋白-3b（BMP-3b）的鉴定，BMP-3的新成员。”