新規骨形成タンパク質(BMP-3b)の生体における生理作用及び作用機序の解明

阐明新型骨形态发生蛋白（BMP-3b）在活体内的生理效应和作用机制

• 批准号: 09771130
• 负责人: 日野 純
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: National Cardiovascular Center Research Institute
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09771130/
• 关键词: BMP-3b; 骨形成タンパク質

1. 申請者らが固定した新規骨形成タンパク質BMP-3bの機能解明を目的にリコンビナントタンパク質を調製を試みた。(1) リコンビナントタンパク質の精製従来の方法でのリコンビナントタンパク質の取得では、発現量とプロセシング効率が悪く(8lの培養上清から50μg)、実用的な実験検討が困難であったので、新たな調製方法を検討した。その結果、同族のBMP-2のプロ体とBMP-3bの成熟体部分を結合させ、さらに、プロセス部位直後にFLAGを結合したキメラタンパク質をコードする発現ベクターが最適であった。このベクターをCHO細胞にトランスフェクションし、血清含有培地にてリコンビナントタンパク質を分泌させると、極めて効率的にしかも容易にリコンビナントタンパク質が得られた(8lの培養上清から0.8mg)。(2) リコンビナントタンパク質の確認リコンビナントタンパク質100ngをウエスタンブロッティングにて検出したところ、予想通り、13kDの大きさのBMP-3bであることを確認した。また、ブロットしたタンパク質のN末端配列解析からも、予想された位置でプロセシングされたBMP-3bであることを確認した。2. 初代骨芽細胞培養系におけるBMP-3b遺伝子の発現調節の検討を行ったところ、以下のような結果を得た。(1) BMP-3b遺伝子の発現は、株化している骨芽細胞様細胞では検出できなかったが、分化状態を維持している初代培養骨芽細胞においては、多量に発現していることを確認した。(2) BMP-3b遺伝子の発現量は、初代培養骨芽細胞の長期培養による分化の進行状態(アルカリカリフォスファターゼ活性の増加及び石灰化を伴う)に応じて、顕著に増加した。(3) また、BMP-3b遺伝子は、初代培養骨芽細胞をBMP-2(骨形成促進因子)で刺激することにより(アルカリカリフォスファターゼ活性及び石灰化が亢進する)、その発現量が約7倍に増加した。(4) 一方、増殖因子であるTGF-β1での刺激により(アルカリフォスファターゼ活性及び石灰化が強力に抑制される)、BMP-3b遺伝子発現は、迅速かつほぼ完全に抑制された。以上の結果より、BMP-3bは、高度に分化した骨芽細胞において、重要な機能を有するタンパク質であることが示唆された。

1. The applicant shall fix the new structure to form the functional definition of BMP-3b, and shall try to adjust the quality of BMP-3b. (1)A method for refining the quality of the product is described. A method for obtaining the quality of the product is described. As a result, the mature part of BMP-2 and BMP-3b were combined, and the FLAG was combined directly after the position of BMP-2. CHO cell culture medium, serum containing culture medium, serum secreting medium, extremely efficient culture medium, easy to obtain culture medium (8l culture supernatant: 0.8mg). (2)The identification of the quality of the file is 100ng, and the identification of the BMP-3b of the 13kD file is 13kD. The N-terminal alignment of the protein was determined by the analysis of its position and the identification of its position. 2. The regulation of BMP-3b gene expression in primary bone bud cell culture was studied. (1)BMP-3b gene expression was confirmed in primary culture of bone bud cells after differentiation. (2)BMP-3b gene production was similar to that of primary cultured bone bud cells during long-term culture and differentiation. (3)BMP-3b gene expression increased approximately 7-fold in response to BMP-2(bone formation promoter) stimulation in primary cultured bone bud cells. (4)For one, TGF-β1 is stimulated by growth factors, and BMP-3b is stimulated by growth factors (strong inhibition of TGF-β 1 activity and calcification). The above results show that BMP-3b is highly differentiated and has important functions.

项目成果

Hino J., et al.: "Bone morphogenetic protein-3b(BMP-3b)gene expression is correlated with differentiation in rat calvarial osteoblasts." Biochem.Biophys.Res.Commun.(in press). (1999)

Hino J. 等人：“骨形态发生蛋白-3b (BMP-3b) 基因表达与大鼠颅骨成骨细胞的分化相关。”