マウス胎仔内耳細胞の遺伝子改変技術の確立(先天性難聴の治療に向けて)

小鼠胎儿内耳细胞基因改造技术的建立（针对先天性听力损失的治疗）

基本信息

批准号：
12671645
负责人：
大島猛史
金额：
$ 2.43万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12671645/
关键词：
難聴蝸牛遺伝子治療内耳

项目摘要

現在、1000出生に1例が高度難聴を来たし、この半数以上が遺伝子異常に起因するといわれている。また、老人性難聴なども何らかの遺伝的素因が関与していることが考えられ、難聴の診断、治療などの戦略に遺伝子は重要な位置を占めることとなった。難聴の原因遺伝子は100個くらいあるといわれるが、GJB2が最も頻度が高く、臨床的意義が大きい。GJB2の遺伝子変異は数多く報告されているが、この中でも日本人に多い235delC,V37I,R143Wについてin vitroで機能解析を行うため患者血液から変異体cDNAをクローニングした。また、蝸牛内で特異的に発現しているモーター蛋白質prestinが最近報告された。これに関係した疾患はまだ報告されていないが、将来的な遺伝子治療に応用する可能性を検討するため、この全長cDNAをスナネズミ蝸牛からクローニングした。これら遺伝子を蝸牛内細胞に遺伝子発現させるにあたり、遺伝子導入方法を検討する必要がある。導入に用いるべクターとしては、ウイルス性と非ウイルス性があるが、まず、高効率での発現が見込まれるアデノウイルスを用いることとした。導入に関する諸条件を検討するためのレポーター遺伝子として大腸菌ベータガラクトシダーゼをアデノウイルスベクターに組み込んだ。これには、クロンテック社のAdeno-X Expression Systemを用いた。モルモットを麻酔後、耳後部切開して蝸牛骨包を露出した。正円窓山来、あるいはcochleostomyを行い少量のウイルス液を注入した。48-72時間後、断頭しX-galにて発色反応を行ったところ、蝸牛管内に遺伝子発現が確認された。

目前，每1000名出生的案例遭受严重的听力损失，据说其中一半以上是由遗传异常引起的。还认为，某些遗传易感性可能与老年听力损失有关，并且基因已成为诸如诊断和治疗听力损失的策略中的重要作用。据说大约有100个基因会导致听力损失，但是GJB2是最常见的，并且具有很大的临床意义。已经报道了GJB2中的许多基因突变，其中包括突变cDNA从患者血液中克隆，以对235delc，v37i和R143W的功能分析，这在日本人群中很常见。此外，最近报道了在耳蜗中专门表达的运动蛋白prestin。尚未报道与此相关的疾病，但是为了研究未来基因治疗中的潜在应用，将全长cDNA从Gerbil耳蜗中克隆。当在2句内细胞中表达这些基因时，有必要考虑一种基因转移方法。用于引入的载体是病毒和非病毒，但首先使用了腺病毒，预计会以高效率表达。大肠杆菌β乳糖苷酶被纳入腺病毒载体，作为研究引入条件的记者基因。这是使用Crontech的Adeno-X表达系统完成的。麻醉豚鼠后，打开后耳切口以暴露耳蜗骨窝。将少量病毒注入了Shoen Madoyama Rai或耳chle术。 48-72小时后，用斩首x-gal进行了色彩反应，并在耳蜗管中证实了基因表达。