神経回路形成に関わるラミニン様細胞外基質の同定と機能解析

本研究は、発達時期の異なる脳シナプス膜画部を用いて作成した2種の抗体で脳の遺伝子発現ライブラリーを差分スクリーニングし、神経回路の形成・成熟に関わる新たな蛋白の遺伝子を得ようとするものである。実験は(1)スクリーニングに用いる抗体の作製、(2)遺伝子発現ライブラリーの準備、(3)抗体を用いたライブラリーのスクリーニング、(4)遺伝子の単離とその構造(塩基配列)の解析、(5)遺伝子産物(蛋白)の機能の解析の5段階に大別され、8年度は(3)・(4)を中心に実施した。生後1日目のラット脳シナプス膜画分由来の抗体および生後90日由来の同様の抗体を用いて、生後90日ラット脳より作製した遺伝子発現ライブラリー5×10^5クローンをスクリーニングした。生後1日由来の抗体より生後90日由来の抗体と強く反応する93クローンを選び出してそれぞれの塩基配列を調べたところ、シナプシンIb、シナプトフィジン、MAPIA、ホスホニューロプロテイン、ジィンクフィンガー蛋白等の既知遺伝子とともに4クローン3種類の未知遺伝子が同定された。ノーザン解析を行ったところ、その3種の未知遺伝子mRNAはそれぞれ約9.5Kb・3.5Kb・3.2Kb大きさであった。引き続いてその3種類の未知遺伝子cDNAの全長を得るべくスクリーニングを行っており、これまでに3種のうち後2者の遺伝子についてはほぼ全長のクローニングに成功した。約9.5Kbの大きさの未知遺伝子についてもcDNA全長を得るべく研究を続けている。

本研究は、発達時期の異なる脳シナプス膜画部を用いて作成した2種の抗体で脳の遺伝子発現ライブラリーを差分スクリーニングし、神経回路の形成・成熟に関わる新たな蛋白の遺伝子を得ようとするものである。実験は(1)スクリーニングに用いる抗体の作製、(2)遺伝子発現ライブラリーの準備、(3)抗体を用いたライブラリーのスクリーニング、(4)遺伝子の単離とその構造(塩基配列)の解析、(5)遺伝子産物(蛋白)の機能の解析の5段階に大別され、8年度は(3)・(4)を中心に実施した。生後1日目のラット脳シナプス膜画分由来の抗体および生後90日由来の同様の抗体を用いて、生後90日ラット脳より作製した遺伝子発現ライブラリー5×10^5クローンをスクリーニングした。生後1日由来の抗体より生後90日由来の抗体と強く反応する93クローンを選び出してそれぞれの塩基配列を調べたところ、シナプシンIb、シナプトフィジン、MAPIA、ホスホニューロプロテイン、ジィンクフィンガー蛋白等の既知遺伝子とともに4クローン3種類の未知遺伝子が同定された。ノーザン解析を行ったところ、その3種の未知遺伝子mRNAはそれぞれ約9.5Kb・3.5Kb・3.2Kb大きさであった。引き続いてその3種類の未知遺伝子cDNAの全長を得るべくスクリーニングを行っており、これまでに3種のうち後2者の遺伝子についてはほぼ全長のクローニングに成功した。約9.5Kbの大きさの未知遺伝子についてもcDNA全長を得るべく研究を続けている。