ヒャクニチソウ管状要素分化実験系を用いたリグニン合成ペルオキシダーゼ遺伝子の解析

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ヒャクニチソウ単離葉肉細胞からの管状要素分化実験系を用い、分化特異的に二次細胞壁形成時にのみ一過的に発現するリグニン合成ペルオキシダーゼ遺伝子ZPO-Cが単離された。本研究ではリグニン合成制御機構解明のため、ZPO-C遺伝子についてのさらに詳細な解析を行った。<局在制御機構の解析> 免疫組織化学及び免疫電顕観察のため、アフィニティーカラムを作成し、抗ZPO-C抗血清から抗ZPO-Cタンパク質特異抗体を精製した。この抗体を用い植物体を材料として免疫組織化学法による局在解析を行った結果、ZPO-Cタンパク質は、道管の細胞壁に局在化することが示された。また、分化実験系では、ZPO-Cタンパク質は分化した管状要素にのみ存在することが示された。さらに、分化過程の管状要素を材料として免疫電顕観察を行った結果、ZPO-Cタンパク質はゴルジ小胞を介して形成過程の二次細胞壁に輸送され、組み込まれることが示唆された。さらに、ZPO-Cタンパク質局在部位にリグニンが沈着することが示された。<活性制御機構の解析> 分化過程の管状要素から細胞壁イオン結合性ペルオキシダーゼを抽出し、Native PAGE後、特異抗体を用いてウエスタンブロッティングすることにより、塩基性ペルオキシダーゼアイソザイムの一つがZPO-C遺伝子に対応することが示された。以下の結果より、ZPO-C遺伝子のコードするペルオキシダーゼアイソザイムが、管状要素のリグニン化を時間的、空間的に厳密に制御していることが示唆された。なお、購入した、紫外可視分光光度計(DU530:ベックマン)は、研究全般に渡って、タンパク質・核酸の定量、酵素活性の測定等のために用いた。