酸素反応の局所制御技術の開発

1分子の染色体DNAを末端からDNA断片を調製した上でリンカーDNAと連結し、PCR増幅と組み合わせることによりゲノムDNA解析の大幅な簡素化が期待される。この工程を実現するためには、染色体DNAのような巨大なDNA分子を操作する技術、1分子DNAの切断技術、1分子DNAのリンカーDNAへの連結技術、1分子PCR技術の各要素技術を実現していく必要がある。これらの要素技術の中で、本研究では巨大DNA分子の操作技術および1分子DNAの切断技術に焦点を絞って開発を進めてきた。巨大DNA分子を操作するにあたり、もっとも問題となるのは溶液中の流れに伴うせん断応力によるDNA分子の断片化である。DNA分子にグロビュールと呼ばれる相転移を導入することにより、巨大DNA分子でも断片化を起こすことなく操作できることを明らかにした。また、この構造は高度に凝縮した構造であるために、媒質との間で屈折率が高められると考え、レーザートラップを行ったところ、染色体DNA1分子の直接レーザートラップが可能であることが判明した。1分子DNAの切断技術としては制限酵素反応を局在化する方法が考えられる。現在までにレーザー照射により、約10μm程度の局所的な領域のみ酵素反応の至適温度を実現することにより制限酵素の活性化を局所化することが可能であることを確認した。さらに高精度の温度制御を行うことを目指して、温度により色彩が転移する液晶微粒子を用いて温度制御を行うことを試みたが、転移が不十分で計測・制御が難しいことが判明した。一方、マグネシウムイオン濃度の局所化を用いる方法に関しては、マイクロシリンジをマイクロフィーダによりドライブすることにより、界面の位置の制御が可能であることを明らかにしたが、現在までにはキャピラリー中に固定したDNA分子を対象とする制限酵素反応の局在化は確認されていない。

1分子の染色体DNAを末端からDNA断片を調製した上でリンカーDNAと連結し、PCR増幅と組み合わせることによりゲノムDNA解析の大幅な簡素化が期待される。この工程を実現するためには、染色体DNAのような巨大なDNA分子を操作する技術、1分子DNAの切断技術、1分子DNAのリンカーDNAへの連結技術、1分子PCR技術の各要素技術を実現していく必要がある。これらの要素技術の中で、本研究では巨大DNA分子の操作技術および1分子DNAの切断技術に焦点を絞って開発を進めてきた。巨大DNA分子を操作するにあたり、もっとも問題となるのは溶液中の流れに伴うせん断応力によるDNA分子の断片化である。DNA分子にグロビュールと呼ばれる相転移を導入することにより、巨大DNA分子でも断片化を起こすことなく操作できることを明らかにした。また、この構造は高度に凝縮した構造であるために、媒質との間で屈折率が高められると考え、レーザートラップを行ったところ、染色体DNA1分子の直接レーザートラップが可能であることが判明した。1分子DNAの切断技術としては制限酵素反応を局在化する方法が考えられる。現在までにレーザー照射により、約10μm程度の局所的な領域のみ酵素反応の至適温度を実現することにより制限酵素の活性化を局所化することが可能であることを確認した。さらに高精度の温度制御を行うことを目指して、温度により色彩が転移する液晶微粒子を用いて温度制御を行うことを試みたが、転移が不十分で計測・制御が難しいことが判明した。一方、マグネシウムイオン濃度の局所化を用いる方法に関しては、マイクロシリンジをマイクロフィーダによりドライブすることにより、界面の位置の制御が可能であることを明らかにしたが、現在までにはキャピラリー中に固定したDNA分子を対象とする制限酵素反応の局在化は確認されていない。