種子貯蔵タンパク質の生合成と分解に関与するプロテアーゼに関する研究

种子贮藏蛋白生物合成和降解相关蛋白酶的研究

• 批准号: 09760123
• 负责人: 渡邊 寛人
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09760123/
• 关键词: rice; storage protein; asparaginyl endopeptidase; イネ; 貯蔵タンパク質; プロテアーゼ

種子貯蔵タンパク質は、生合成過程において限定分解を受けて前駆体より成熟化する。本研究ではイネ種子において限定分解を担うと考えられるアスパラギン残基特異的なプロテアーゼ(asparaginyl endopeptidase;AEP)の性質について検討した。まず、イネ種子AEPのcDNAを用い、組み換えAEP前駆体タンパク質を大腸菌により大量発現させた。その結果、このタンパク質は不溶性となり、酵素化学的性質をしらべることは困難であった。そこで、不溶性発現タンパク質の可溶化・再構成を試みた。その結果、0.7%ザルコシンにより可溶化し、その後還元型および酸化型グルタチオンの存在下で透析を行ってザルコシンを除くことにより、可溶性の組み換え体を得た。次に組み換え体の酵素活性を検討した。基質として、イネ種子の主要な貯蔵タンパク質であるグルテリンのプロセシング部位周辺の配列GCPNGLDETFのペプチドを用いた。このペプチドを組み換え前駆体タンパク質とインキュベートし、生成物をHPLCで精製した後、その構造をしらべた結果、生成物はGCPNとGLDETFであった。このことからイネ種子AEPは自己触媒的に活性を有する成熟型酵素となってアスパラギン残基のC末端側を切断することが明らかとなった。また実際にイネ種子においてグルテリンの成熟化に関与していることが強く示唆された。さらにノーザン分析によりmRNAの発現状態を観察したところ、イネ種子AEPは種子の登熟・発芽の両過程にわたって発現していることが確認された。またRT-PCRによるクローニングの結果、イネ種子にはこれまで解析してきたものとは一次構造の異なる、新たなAEPmRNAが発現していることも明らかとなった。

The seed storage process is characterized by limited decomposition and maturation of the precursor. In this study, we investigated the properties of asparaginyl endopeptide (AEP), which is a residue-specific enzyme in the seed. AEP cDNA is used in the production of AEP, and AEP precursor is expressed in large quantities in E. coli. The result is that the enzyme chemistry is insoluble and difficult. The solubility and reconstitution of insoluble substances were tested. The results showed that 0.7% of the solution was soluble, and the solution was soluble. The enzyme activity of the second group was investigated. The main storage medium of the substrate and the main storage medium of the seed are used in the selection of the GCPNGLDETF at the periphery of the substrate. The results of HPLC purification and structure analysis show that GCPN and GLDETF can be used as raw materials. The mature enzyme has the activity of self-catalysis, and the C-terminal side of the enzyme is cut off. In the process of development, the seeds are grown and mature. In addition, the expression status of mRNA was observed using gene analysis, and it was confirmed that AEP in rice seeds was expressed during the ripening and germination process of seeds. The results of RT-PCR were analyzed and new AEP mRNA was detected.