血管内皮細胞の機械刺激受容機構の解明

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機樋受容リセプターである機械受容チャネルのクローニングを目指した。研究実施計画に従い、いくつかのチャネルの種を通して保存されている領域に対するdegenerate primerを作製し血管内皮細胞および心筋細胞に対してスクリーニングを行った。これまでのところ心筋細胞においてカルシウム依存性・ATP感受性の機械受容チャネルの部分的なシークエンスを確認した。電気生理学的解析:トリ培養心筋細胞には5種類の機械受容チャネルが存在することを確認した。特に、コンダクタンスが200pSの機械受容チャネルについて解析を進めたところ、細胞内カルシウムに感受性を持ちサソリ毒キャリブドトキシンにより阻害される巨大コンダクタンス型カルシウム依存性カリウムチャネル(BK channel)であることが判明した(Am.J.Physiol.印刷中)。分子生物学的解析:上記の機械受容チャネルのクローニングを行った。(1)BK channelの保存領域に対するdegenerate primerを作製た。(2)PCRを行ったところ予想される分子量にPCR産物が増幅された。(3)PCR産物をTAクローニングしシークエンスを行ったところ既知の塩基配列と高い相同性を持つ部分を得ることができた。(4)培養心筋細胞からmRNAを抽出しcDNAライボラリーを作製した。(5)cCDNAライボラリーをλファージベクターに組込んだ。(6)上記配列をプローブとしプラークハイブリダイゼーションを行った。(7)3種類の陽性クローンが取れた。(2)これまで確認されているトリBK channelと高い相同性があることが確認できた。(9)発現ベクターを構築した。(10)パッチクランプにて解析中である。